Биотехнология в животноводстве (90

заранее подготовленные растворы криопротектора убывающей концентрации.

После выдержки эмбрионов в растворе криопротектора низкой концентрации их 3 раза по 10 мин. промывают в свежем растворе ФБС, затем оценивают по шкале морфологической оценки.

Вопросы для самоконтроля

1.Значение метода криоконсервации в животноводстве.

2.Вещества, используемые в качестве криопротекторов, глицерин и его свойства.

3.В чём заключается защитный эффект ступенчатого охлаждения эм-

брионов

4.Сущность технологии замораживания эмбрионов.

5.Порядок оттаивания эмбрионов.

2.5Основы молекулярной генетики.

Вкачестве объектов молекулярной биотехнологии используются различ-

ные биологические системы: микроорганизмы, клеточные линии насекомых,

растений, млекопитающих, вирусы насекомых, растений и млекопитающих,

многоклеточные организмы, выбор системы зависит от целей эксперимента.

Основными «рабочими лошадками» в молекулярной биотехнологии являются бактерии Escherichia coli, одноклеточные дрожжи Saccharomyces cerevisiae и

различные клеточные линии животного происхождения.

Все живые организмы делятся на две основные группы: прокариоты и эу-

кариоты.

Отличительными особенностями данных клеток являются наличие или отсутствие ядра, содержащего хромосомную ДНК, строение и химический со-

став клеточной стенки наличие или отсутствие субклеточных цитоплазматиче-

ских органелл.

21

Кишечная палочка Escherichia coli является прокариотическим организ-

мом, хромосомная ДНК которой находится непосредственно в цитоплазме,

клетка окружена ригидной клеточной стенкой, в клетке нет субклеточных ци-

топлазматических органелл. Логичность и простота схемы данного организма дала возможность считать её универсальной для всего живого, в том числе и для эукариотических организмов, имеющих ядро, к которым относятся живот-

ные, растения и человек.

Вся информация о строении и функционировании любого живого орга-

низма содержится в закодированном виде в его генетическом материале, основу которого составляет ДНК.

Молекула ДНК – сложный биополимер, имеющий у эукариот двухнитча-

тую спиральную форму, у прокариот – однонитчатую. Навитые одна на другую полинуклеотидные цепи удерживаются вместе водородными связями, обра-

зующимися между комплементарными основаниями противоположных цепей.

Каждый нуклеотид состоит из фосфора, сахара, и четырёх азотистых основа-

ний: пуриновых – аденин (А), гуанин (Г) и пиримидиновых – тимин (Т) и цито-

зин (Ц). При этом аденин образует пару только с тимином, а гуанин – с цитози-

ном. В состав молекулы ДНК входят, чередуясь в определённой последова-

тельности, многие тысячи нуклеотидов.

Число нуклеотидов и их последовательность в молекуле ДНК специфич-

ны для каждого вида организмов и конкретной особи. Длинная молекула ДНК несёт информацию о том, как расположены аминокислоты в белках, и тем са-

мым определяет их функциональные возможности. Процесс реализации на-

следственной информации в биосинтезе осуществляется при участии трёх ви-

дов рибонуклеиновых кислот (РНК): информационной (матричной) – и РНК (м

РНК), рибосомальной – р РНК и транспортной – т РНК. Все рибонуклеиновые кислоты синтезируются на соответствующих участках молекул ДНК. Процесс биосинтеза сложный и включает ряд этапов – транскрипцию, сплайсинг и трансляцию. Молекула ДНК, находящаяся в ядре, способна к самовоспроизве-

дению – репликации. Первый этап биосинтеза заключается в накоплении до-

22

черних молекул ДНК. Молекула ДНК на данном этапе служит матрицей. С ка-

ждой нити матричной ДНК списываются комплементарно последовательность и состав нуклеотидов, образуя молекулу информационной РНК. Этот процесс называется транскрипцией.

Транскрипция – (переписывание, копия) происходит в ядре клетки: на участке определённого гена молекула ДНК синтезируется м РНК. В синтезе участвует комплекс ферментов, главным из которых является РНК-полимераза.

После транскрипции, в результате которой на нити и РНК записана последова-

тельность нуклеотидов матричной ДНК, происходит вырезание (рестрикция) из и РНК незначащих участков РНК (нитронов) и соединение в общую нить,

склеивание значащих участков ДНК (экзонов). Процесс вырезания и склеива-

ния экзонов называется сплайсингом. После сплайсинга формируется нить и РНК, её молекулы переходят из ядра в цитоплазму клетки и направляются к ри-

босомам.

Трансляция – происходит в цитоплазме на рибосомах при участии т РНК.

Транспортные РНК синтезируются в ядре, но функционируют в свободном со-

стоянии в цитоплазме клетки.

Вопросы для самоконтроля

1.Какие организмы являются основными «рабочими лошадками» в

молекулярной биотехнологии.

2.Какие РНК участвуют в синтезе белка?

3.Отличительные особенности прокариотов и эукариотов.

4.Что такое репликация, трансляция, транскрипция?

5.Что из себя представляет схема синтеза белка?

6.Как называются участки хромосом, которые не несут кодирующей информации

23

2.6 Инструменты генетической инженерии, технология рекомби-

нантных ДНК

Технология рекомбинантных ДНК (молекулярное клонирование) – это совокупность экспериментальных процедур, позволяющая осуществлять пере-

нос генетического материала из одного организма в другой. В генетической инженерии для конструкции рекомбинантных ДНК используются ферменты:

рестриктаза, ДНК-полимераза, ДНК-лигаза. Рестрикционные эндонуклеазы (ре-

стриктазы) представляют собой особый класс эндонуклеаз, которые гидроли-

зуют ДНК строго по определенным специфическим последовательностям, на-

зывающимися сайтами рестрикции. Каждая из рестриктаз узнает свой сайт ре-

стрикции и разрезает ДНК либо внутри последовательности сайта рестрикции,

либо в непосредственной близости от него. Таким образом, при действии кон-

кретной рестриктазы одна и та же последовательность ДНК будет всегда обра-

зовывать одинаковый набор фрагментов. ДНК путем присоединения компле-

ментарного нуклеотида, это свойство используется при создании ДНК-библиотек,

для заполнения «бреши» в цепи ДНК. ДНК-лигаза осуществляет одну функцию – соединение фрагментов ДНК путем восстановления фосфодиэфирных связей между соседними нуклеотидами. Этот процесс называется лигированием. Лига-

зы в клетках участвуют как в синтезе ДНК, так и при восстановлении нормаль-

ной структуры ДНК после частичного повреждения генетического аппарата.

Выделенные фрагменты ДНК соединяются в пробирке, после этого их необходимо ввести в живые клетки. Для этого используют специальные моле-

кулы – векторы. Для переноса генетической информации используются плаз-

миды и бактериофаги (вирусы), называемые векторами. Плазмиды – это вне-

хромосомные, автономно реплицирующиеся двухцепочечные кольцевые моле-

кулы ДНК. Плазмиды есть практически у всех бактерий. Бактерии имеют опре-

деленное преимущество над высшими формами, а именно:

24

число многоклеточных животных в экспериментах ограничено сотнями или в лучшем случае несколькими тысячами, а их жизненный цикл длит-

ся неделями или месяцами;

в экспериментах на бактериях можно использовать большое их число с жизненным циклом меньше часа;

бактериальная клетка построена значительно проще клетки эукариот.

Бактерии размножаются бесполым путем – делением клетки надвое, не-

которые бактерии делятся очень часто, каждые 20 минут. Через несколько ча-

сов колония состоит уже из миллионов генетически идентичных бактерий, об-

разующих клон.

В 1974 году был предложен один из первых плазмидных векторов E.coli – Col E 1. Этот вектор является самым простым и имеет лишь один сайт узнава-

ния рестриктазы Eco R 1. Плазмида E.coli представляет собой небольшую коль-

цевую молекулу ДНК, расщепляемую рестриктазой Eco R 1 только в одном месте. Данная плазмида служит основой для конструирования новых производ-

ных векторов. Векторы на основе бактериальных плазмид широко используют-

ся для клонирования, но у них есть один важный недостаток – небольшая ем-

кость. Для клонирования больших фрагментов ДНК используются фаговые векторы – космиды. Космиды могут включать до 40 т.п.н. чужеродной ДНК, и

при этом активно амплифицироваться в E.coli как плазмиды.

Вопросы для самоконтроля

1.Основные инструменты генетической инженерии их свойства, применение.

2.Дать определение вектору. Какой вектор является самым простым, предло-

женным одним из первых в данном качестве.

3.Какие векторы используют для клонирования больших фрагментов ДНК?

4.Плазмиды, их свойства и требования предъявляемые к ним.

5.Отличительные признаки бактерий и многоклеточных форм, используемых в генетической инженерии.

25

2.7 Создание трансгенных организмов

Мощное развитие животноводства за последние десятилетия привело к появлению выдающихся пород животных. Продуктивность молочного скота у некоторых пород достигла 8-9 тыс.кг. Комплекс селекционных приемов, ис-

пользуемых в молочном скотоводстве, называется крупномасштабной селекци-

ей. Она обеспечивает очень эффективный отбор производителей, создание больших запасов замороженной спермы от выдающихся быков, отбор и эффек-

тивное использование лучших коров. Методы гормональной суперовуляции и трансплантации позволяют получать от лучших коров десятки зигот в год и вы-

ращивать их в коровах, имеющих более низкую племенную ценность. Вся сис-

тема управляется из единого информационного центра. Такая широкомасштаб-

ная селекция позволяет повышать продуктивность породы на 1-2% в год. Это очень высокий показатель для таких медленно размножающихся животных, как крупный рогатый скот.

Успехи, достигнутые в выделении генов высших организмов, их реком-

бинирования с бактериальными плазмидами, интеграция чужеродной инфор-

мации в животную клетку позволило разработать принципиально новый био-

технологичесикй метод по созданию животных. Трансгенные животные – это индивидуумы, в геном которых искусственно введена дополнительная генети-

ческая информация (трансген). Трансген – это искусственно введенный и ин-

тегрировавшийся в ДНК животных чужеродный ген. Трансгеноз – процесс пе-

реноса и интеграции чужеродной генетической информации в геном животных.

Процесс переноса генетической информации осуществляется разными спосо-

бами: микроинъекция гена, пересадка генетически трансформированных клеток в энуклеированную яйцеклетку, пересадка гена с использованием ретровируса,

пересадка гена путем введения его в сперму.

Получение трансгенных животных путем микроинъекции гена включает в себя извлечение эмбриона на стадии пронуклеуса хирургическим путем или после убоя доноров. На столике микроскопа устанавливают инъекционную ка-

26

меру со средой, покрытой парафиновым маслом. В среду помещают эмбрионы.

ДНК в пронуклеус эмбриона вводится с помощью инъекционной пипетки. По-

сле короткого (до нескольких часов) культивирования in vitro эмбрионы транс-

плантируют в яйцевод синхронизированных реципиентов.

Коровам и кобылам эмбрионы вводят нехирургическим путем. Каждому реципиенту мыши, кролика и свиньи пересаживают 20-30 инъецированных зи-

гот, причем у свиней все эмбрионы трансплантируют в один яйцевод, а у мы-

шей и кроликов – раздельно по яйцеводам. У овец, коз, крупного рогатого скота каждому реципиенту пересаживают два-четыре эмбриона.

Пересадка генетически трансформированных клеток в энуклеированную яйцеклетку. В отличие от микроинъекции гена в пронуклеус зигот этим мето-

дом ген вводят в соматические клетки, которые затем подсаживают к энуклеи-

рованным ооцитам и соединяют их с цитоплазмой, как правило, электрослия-

нием. Реконструированные ооциты трансплантируются животным-

реципиентам. В птицеводстве необходимый ген вводят в зародышевые клетки донора путем обычной трансфекции в культуре клеток, как это делается на жи-

вотных. Затем трансфецированные зародышевые клетки снова пересаживают в зародыш реципиента, который продолжает развиваться до вылупления. Таким образом, получают кур, продуцирующих с яйцом различные лекарственные белки.

Пересадка гена с использованием ретровируса. Впервые данная методика была опробирована на курах, мышах, а в 2001 году и на крупном рогатом скоте.

Методика с использованием ретровирусов имеет высокую эффективность инте-

грации гена. В последних исследованиях было получено четыре из четырех трансгенных телят путем введения гена в ооцит на стадии метафазы II. Однако существуют и недостатки метода с использованием ретровируса.

Во-первых, это относительно маленькое количество генетической ин-

формации, которое может быть перенесено ввиду малого объема вирусных час-

тиц. Это создает проблему получения низкой экспрессии гена, что ограничива-

ет практическое использование этого приема. Другим недостатком этого метода

27

является его сложность. Упаковка трансгенов в вирус осложняется техникой изготовления генной конструкции, введения ее в геном ретровируса. После то-

го, как вирусы будут сконцентрированы, они могут быть введены в ооцит.

Пересадка генов путем введения его в сперму. Пересадка генов таким приемом в настоящее время продемонстрирована на нескольких видах живот-

ных. Эффективность интеграции экспрессии и передачи введенных генов очень высокая. Для соединения трансгенов со спермиями используются монокло-

нальные антитела.

В связи с разработкой метода введения чужеродных генов в геном живот-

ных реципиентов появилась возможность создавать животных с совершенно новыми свойствами, связанными с улучшением продуктивности и качества животноводческой продукции, резистентности к болезням и создание трансгенных животных – биореакторов ценных биологически активных веществ.

В мире уже существуют сотни трансгенных овец и коз, продуцирующих в молоке от десятков миллиграмм до нескольких грамм биологически активных белков человека в 1 литре молока. Такой метод производства экономически вы-

годен и экологически чище, хотя и требует от ученых больших усилий и време-

ни при создании трансгенных животных по сравнению с созданием генно-

инженерных микроорганизмов. С молоком трансгенных животных можно по-

лучать не только лекарства. Известно, что для производства сыра высокого ка-

чества необходим фермент, створаживающий молоко - ренин. Этот фермент добывают из желудков молочных телят. Он дорог и не всегда доступен. Нако-

нец, генные инженеры сконструировали дрожжи, которые стали производить этот ценный белок при микробиологическом синтезе.

Следующий этап генной инженерии – создание трансгенных овец, кото-

рые синтезируют химозин в молоке. Небольшое стадо наших овец в России на-

ходится на Ленинских Горках под Москвой. Эти овцы синтезируют до 300

мг/л фермента в молоке. Для процесса сыроварения белок можно не выделять, а

использовать просто в составе молока.

28

Трансгенные животные широко используются как для решения большого числа теоретических задач, так и в практических целях для биомедицины и сельского хозяйства. Некоторые научные проблемы не могли бы быть решены без создания трансгенных животных. На модели трансгенных лабораторных животных проводятся широкие исследования по изучению функции различных генов, регуляции их экспрессии, фенотипическому проявлению генов, инсерци-

онному мутагенезу и др. Трансгенные животные важны для различных биоме-

дицинских исследований.

В практических целях трансгенные животные используются различными зарубежными фирмами как коммерческие биореакторы, обеспечивающие про-

изводство разнообразных медицинских препаратов (антибиотиков, факторов свёртываемости крови и др.). Кроме того, перенос новых генов позволяет полу-

чать трансгенных животных, отличающихся повышенными продуктивными свойствами (например, усиление роста шерсти у овец, понижение содержания жировой ткани у свиней, изменение свойств молока), устойчивостью к различ-

ным заболеваниям, вызываемым вирусами и другими патогенами. В настоящее время человечество уже использует множество продуктов, получаемых с по-

мощью трансгенных животных.

Вопросы для самоконтроля

1.Способы получения трансгенных животных, их свойства.

2.Дать определение трансгенным организмам.

3.Как осуществляется процесс переноса генетической информации в пти-

цеводстве?

4.Какое практическое значение имеют трансгенные животные и растения?

29

2.8 Химеры и способы их получения

Понятие химера (греч. Chimaira) означает составное животное. По клас-

сификации К. Форда следует различать первичный химеризм, когда разные клеточные популяции сосуществуют с момента оплодотворения или раннего эмбриогенеза и вторичный, при котором комбинируются ткани от двух и более взрослых особей или эмбрионов после начала глубокой клеточной дифферен-

цировки.

В настоящее время одним из перспективных направлений биотехнологии является искусственное получение химер или генетических мозаиков.

Сущность такого биотехнического метода, основанного на достижениях клеточной инженерии и микроманипуляций на ранних эмбрионах, заключается в искусственном объединении эмбриональных клеток двух или более живот-

ных. Полученные животные - химеры несут признаки разных генотипов. Со-

временная микрохирургия позволяет получать химер, имеющих четырёх и бо-

лее родителей.

Агрегационный метод. Сущность метода заключается в следующем: два эмбриона, различающиеся генотипами на стадии 8 – 12 бластомеров, обрабаты-

вают протеолитическим ферментом проназой, освобождают от прозрачной оболочки и сближают друг с другом в культуральной среде до образования бла-

стоцисты. Агрегационные химеры можно получать не только между двумя эм-

брионами, но и между различным числом изолированных бластомеров или от-

дельными частями эмбрионов. Преимущество агрегационного метода состоит в том, что он не требует вмешательства микрохирургической техники.

В будущем благодаря применению этого метода появится возможность решать сложные проблемы генетики и эмбриологии.

Инъекционный метод. Данный метод требует применения микроманипу-

ляционной техники и микроскопического вмешательства. При инъекционном способе используются эмбрионы, находящиеся на стадии бластоцисты. Бласто-

цисту удерживают всасывающей пипеткой, и используя микроманипуляторы, в

30