Биотехнология в животноводстве (90

Суперовуляцию считают достигнутой у коров и кобыл, если произошло выделение не менее трех яйцеклеток. Основной целью гормональной обработки является получение в результате суперовуляции 10-20 оплодотворенных яйце-

клеток.

ФСГ – активизирует рост первичных фолликулов и заключенных в них яйцеклеток. (Оптимальная доза 32-50 мл.)

ЛГ – вызывает разрыв фолликулов, овуляцию и образование желтого тела на месте лопнувшего фолликула (20% от дозы ФСГ).

Женские половые гормоны.

Эстроген – выделяется фолликулами. Стимулирует рост и функции мат-

ки, подготавливает половые органы для восприятия спермы.

Прогестерон – вырабатывается желтым телом. Осуществляет подготовку слизистой оболочки матки к имплантации оплодотворенной яйцеклетки, обра-

зования плаценты и нормального протекания беременности.

Простагландин ПГФ - вызывает регрессию желтого тела, половую охо-

ту, овуляцию.

Коровы-доноры по-разному реагируют на гормональную обработку. При-

нято всех коров-доноров разделять на три группы: хорошо реагирующие; удов-

летворительно реагирующие; практически не реагирующие.

Доноры, которые не отвечают на обработку суперовуляцией, могут быть использованы для получения эмбрионов после спонтанной охоты.

Вопросы для самопроверки

1.Основное назначение трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных жи-

вотных.

2.Требования, предъявляемые к донорам эмбрионов сельскохозяйственных животных.

3.Особенности организации сухостойного периода коров-доноров.

4.Что такое суперовуляция, и используемые при этом препараты.

11

2.2 Техника и методы извлечение эмбрионов

Оплодотворенные яйцеклетки от коров-доноров могут быть извлечены тремя способами:

После убоя коровы-донора;

Хирургическим путем;

Нехирургическим путем.

Извлечение хирургическим способом. После успешного оплодотворе-

ния яйцеклеток в первой трети яйцевода зигота продвигается через яичник и на пятые сутки в стадии 16-32 клеток, т. е. ранней морулы, достигает рогов матки. Для трансплантации рекомендуется использовать эмбрионы КРС на стадии бластоцисты между 7-8-ми сутками после первого искусственного осеменения (Д0).

Существует несколько способов хирургического извлечения эмбрио-

нов:

Разрез верхнего свода влагалища;

Лапоратомия по белой линии живота;

Лапоратомия в области голодной ямки.

Для извлечения эмбрионов хирургическим способом используют различные инструменты .

Нехирургический способ извлечения эмбрионов. Коров-доноров обследуют на наличие живых клеток, чистят и моют, ограничивают рацион и кратность кормления, а за сутки прекращают кормление и поение. Перед самым извлече-

нием эмбрионов дезинфицируют наружные половые органы коров-доноров.

Для извлечения эмбрионов используют различные инструменты, чаще всего катетер Фолея с упругим мандреном и надувным баллончиком.

Катетер вводят во влагалище по верхнему его своду и проводят под рек-

тальным контролем через шейку в рог матки.

После того как катетер достигнет в роге матки необходимого положения,

мандрен удаляют и в баллончик катетера накачивают 10-15 мл воздуха. Закре-

12

пив катетер, промывают полость рога матки с помощью шприца Люэра вме-

стимостью 50-60 мл. В качестве среды для промывания используют фосфатно-

буферный солевой раствор (ФБС) Дюльбекко.

Вопросы для самоконтроля

1.Способы извлечения эмбрионов.

2.Сроки извлечения эмбрионов.

3.Преимущества нехирургического способа извлечения эмбрионов.

4.Преимущества хирургического способа извлечения эмбрионов

5.Назвать способы хирургического извлечения

6.Основные питательные среды, используемые для промывания рогов матки.

2.3.Методы оценки эмбрионов крупного рогатого скота, пересадка их ре-

ципиентам

Оценку эмбрионов проводят для выявления интактных, дефектных и спо-

собных к развитию. Неспособные к развитию эмбрионы имеют определенные в большей или меньшей степени дефекты. Характеристика состояния эмбрионов необходима, поскольку всякие процедуры и манипуляции, производимые с ни-

ми во время пересадки, существенно влияют на их качество.

При пересадке зародышей требуется определить их жизнеспособность постоянно и исключительно по морфологическим признакам. При этом учиты-

вают следующие основные морфологические признаки полноценности заро-

дышей: целостность и равномерность развития бластомеров, прозрачность пе-

ривителлинового пространства, целостность зоны пеллюцида, соответствие ста-

дий развития возрасту зародыша.

Методы оценки эмбрионов. Для определения полноценности и жизнеспособ-

ности зародышей применяют следующие методы: визуальная морфологическая

13

оценка, прижизненное окрашивание, культивирование вне организма в течение

24 - 48 ч, цитологическая и цитогенетическая оценка.

Морфологическая оценка качества эмбрионов. Эмбрионы оценивают пу-

тем определения стадий развития, состояния оболочек и внутренних структур.

Биологически полноценными принято считать эмбрионы, имеющие правиль-

ную шароообразную форму, гомогенную светлую цитоплазму, неповрежден-

ную прозрачную оболочку, одинакового размера бластомеры с плотным меж-

клеточным контактом. Они должны соответствовать по уровню дробления воз-

расту от оплодотворения до извлечения.

Оценку проводят путем сравнивания результатов исследования с норма-

тивами и ожидаемыми данными в соответствии со стадиями развития объектов.

Оценочную работу проводят по состоянию эмбрионов, их морфологии, вре-

менной схеме развития и по морфологическим изменениям, возникающим при кратковременном их культивировании.

Эмбрионы, которые не достигли определенных стадий развития в указан-

ное время, подвергаются дегенерации, поэтому способность эмбрионов разви-

ваться до экспандированной или начальной бластоцисты служит основным критерием их развития.

В результате данной оценки эмбрионы классифицируют и определяют их пригодность к использованию. В нашей стране принята 5-бальная шкала с уче-

том следующих показателей: соответствия стадии развития эмбриона его воз-

расту; правильности формы прозрачной оболочки и ее целостности, равномер-

ности дробления бластомеров, состояния цитоплазмы, прозрачности периви-

теллинового пространства.

Наиболее пригодными для трансплантации являются эмбрионы, извле-

ченные из матки коровы-донора на 7 - 8 сутки после осеменения.

Выбраковке подлежат дегенерированные неоплодотворенные яйцеклетки

(ооциты): морфологически неинтактные, непригодные для трансплантации эм-

брионы имеют дефектную морулу или бластоцисту, при этом наблюдаются де-

фекты прозрачной оболочки, распад бластомеров, разная величина бластоме-

14

ров, нарушение межклеточной связи.

Оценка эмбрионов с использованием красителей. Этот метод основан на различной степени проницаемости красителей через прозрачную оболочку жи-

вых или погибших эмбрионов к способности окрашивать протоплазму. Для ок-

рашивания используют: синьку Эванса, эозин, раствор нейтрального красного,

метиленовую синь, флуоресцентные красители (акридиноранж, флуорасцеин-

диацетат и др.).

Оценку жизнеспособности проводят под люминисцентным микроскопом,

затрачивая на анализ не более 1,5 минут. У живых клеток красноватое свече-

ние, у погибших - зеленое.

Оценка эмбрионов методом культивирования вне организма. У биологи-

чески полноценных эмбрионов в оптимальных условиях культивирования про-

должается развитие. Для культивирования эмбрионов применяют питательные среды: ТС - 199, Хзм Г - 10, Игла, растворы Дюльбекко, Бринстера с различны-

ми биологическими и синтетическими добавками. Осмотическое давление пи-

тательных сред должно быть около 300 миллиосмолей, pН 7,2 - 7,4. Используе-

мая газовая среда содержит 90% азота, 5% кислорода, 5% диоксида углерода.

Более простой способ - культивирование эмбрионов в пробирках или со-

ломинках. Перед культивированием эмбрионы морфологически оценивают на инвертированном микроскопе МБИ - 13 при увеличении 100 -160 раз. Продол-

жительность культивирования эмбрионов без потери биологических потенций возможна до 95 ч. Эмбрионы, проявившие признаки деления в течение 24 - 48

ч, считаются жизнеспособными.

Цитологические и цитогенетические методы оценки эмбрионов. Исполь-

зуют метод тотальных препаратов и воздушно-сухой метод получения хромо-

сомных препаратов, которые позволяют оценить состояние структур зароды-

шей, состояние хроматина в интерфазных ядрах бластомеров.

Цитологический и цитогенетический анализ ранних зародышей можно использовать для подсчета точного количества бластомеров по числу ядер, для выявления аномалий кариотипа и отдельных хромосом, изучение вопросов

15

биологии размножения, исследования причин эмбриональной смертности. Но эти методы неприменимы для изучения зародышей, предназначенных для трансплантации.

Пересадка эмбрионов реципиентам (подсадка). В качестве реципиента отбирают гинекологически здоровых коров после двух - трех нормальных по-

ловых циклов. Для отбора реципиентов основным показателем является отсут-

ствие гинекологических отклонений, а продуктивные, племенные и породные качества большой роли не играют. Вместе с тем у реципиентов с плохой упи-

танностью, низкой оплодотворяемостью после первого осеменения могут плохо приживляться эмбрионы. В среднем на одного донора отбирают 5-6 реципиен-

тов. Большинство специалистов считает, что в качестве реципиентов наиболее пригодны полновозрастные телки с хорошими племенными кондициями. Это объясняется тем, что, во-первых, крупногрупповое содержание телок по срав-

нению с содержанием коров значительно упрощено и, во-вторых, у телок в противоположность коровам многократная синхронизация полового цикла с помощью простагландинов не вызывает затруднений.

Основным условием хорошего приживления эмбрионов служит синхрон-

ность проявления половой охоты у доноров и реципиентов. Разница по времени в проявлении половой охоты не должна превышать 24 ч, оптимальные же ре-

зультаты получают при разнице не более 12 ч.

При современном уровне техники трансплантации рекомендуется пере-

саживать эмбрионы сразу после извлечения их из рогов матки донора и оценки.

В настоящее время пересадка эмбрионов реципиентам производится хи-

рургическим и нехирургическими способами. При пересадке нужно точно знать местонахождение эмбриона в половых путях коровы.

При естественном течении эмбрионального периода зародыш на стадии морулы или бластоцисты находится в верхнем отделе рога матки, поэтому и наиболее благоприятным местом для его аппликации является верхняя часть рога матки реципиента. Установлено, что пересадка эмбрионов глубоко в рог матки реципиента лучше всего обеспечивается хирургическим способом.

16

При нехирургической же пересадке, которая происходит в период диэст-

руса, место аппликации эмбриона в роге матки контролируется менее точно.

При хирургическом способе пересадки эмбрионов применяют лапаротомию в области белой линии живота или в области подвздоха. Лапаротомия проводится под общим наркозом при спинном положении животного. Длина разреза по бе-

лой линии живота составляет 10 см.

В последние годы чаще применяется пересадка эмбрионов путем лапаро-

томии в области подвздоха при местной анестезии в стоячем положении реци-

пиента. Этот метод более прост и менее трудоемок. Подготовка реципиента и техника операции такие же, как и при извлечении эмбрионов этими методами.

При некотором навыке специалиста продолжительность хирургической пере-

садки эмбриона составляет не более 10—15 мин.

Эффективность хирургического способа пересадки эмбрионов составляет

60—70%, а число телят 3—4 на донора, однако он требует больших затрат,

средств. Кроме того, широкое применение хирургического метода сдерживает-

ся сложностью проведения операции в производственных условиях, получени-

ем травм вследствие резекции мышц и невозможности многократного исполь-

зования реципиента.

При нехирургической пересадке подготовка реципиента проводится так же, как и при подготовке доноров для хирургического извлечение эмбрионов.

Основным преимуществом этого способа, кроме простоты и большой эконо-

мичности, является возможность многократного использования реципиента.

Разработано несколько способов нехирургической пересадки эмбрионов. Одна-

ко все они основаны на одном принципе – введении эмбриона в рог матки через шейку, вследствие чего этот способ назван также цервикальным. Для нехирур-

гической пересадки эмбрионов используют целый ряд специальных инструмен-

тов

Особого внимания заслуживает такой прием, как нехирургическая пере-

садка двух эмбрионов по одному в каждый рог матки, что еще больше повыша-

ет эффективность трансплантации. Этот прием может быть применен для по-

17

вышения частоты рождения разнояйцевых (дизиготных) двоен. Он позволяет получать двойные отелы у коров, особенно мясных пород, намного быстрее,

чем генетическим путем, т. е. селекцией.

Вопросы для самоконтроля

1.Какой способ оценки качества эмбрионов является основным.

2.В каком случае эмбрионы считаются жизнеспособными при использо-

вании метода культивирования.

3.Основное назначение цитогенетического метода.

4.Требования, предъявляемые к реципиентам.

5.Способы пересадки эмбрионов, преимущества и недостатки.

2.4Организация хранения эмбрионов

Применение метода трансплантации эмбрионов требует разработки эф-

фективных методов их хранения в период между извлечением и пересадкой.

Одним из основных методов хранения эмбрионов является криоконсервация.

Метод криоконсервации позволяет сохранять жизнеспособность эмбрио-

нов длительное время (практически неограниченное). Криоконсервирование можно применять для сохранения ценного и редкого генетического материала,

транспортировки зародышей на дальние расстояние и накопления однородного генетического материала для исследовательских работ. Современные методы длительного хранения эмбрионов животных в замороженном состоянии требу-

ют соблюдения двух основных условий:

Применение специальных сред, основной составной частью кото-

рых являются криопротекторы;

Использование оптимальных режимов замораживания и оттаива-

ния.

18

Механизм замораживания и оттаивания эмбрионов. Цитоплазматическое со-

держимое клеток замерзает в интервале температур от 0 до – 30 0 С, а некото-

рые соединение вообще могут не замерзать. Поэтому в клетках животных диа-

пазон температур, при которых происходит окончательное замораживание, на-

ходится в пределах от -50 до -80 0 С.

В качестве криопротекторов используют глицерин, диметилсульфоксид,

поливинилпирролидон, гексоэтиловый крахмал. Наибольшее распространение получил глицерин. Это бесцветная жидкость без запаха, сладковатого вкуса.

Глицерин не кристаллизируется с водой. Он легко проникает в клетку, где об-

разует стабильные водородные связи с водой, благодаря чему уменьшается ко-

личество кристаллизующейся свободной воды, способствует переходу воды в твердую фазу без образования кристаллов.

При насыщении криопротектором эмбрион сжимается вследствие потери воды и это происходит до тех пор, пока выделение воды из клеток не сбалан-

сируется притоком криопротектора. После оттаивания глицерин из эмбрионов удаляют постепенно, путём последовательного переноса их в растворы крио-

протектора понижающейся концентрации. Необходимо учитывать, что концен-

трация глицерина, применяемая при изкотемпературном консервировании эм-

брионов, способна оказывать на них токсическое действие. Поэтому инкубация биологических объектов с криопротекторами должна быть ограничена по вре-

мени. По окончании периода насыщения зародышей глицерином они должны быть немедленно заморожены, а после оттаивания и удаления криопротектора как можно быстрее пересажены реципиентам.

Режим замораживания и оттаивания эмбрионов. Охлаждают эмбрионы в несколько этапов при разной скорости. При температуре от 20 до -5-7 0С ис-

пользуют довольно высокую скорость охлаждения 1-10 град/мин. Далее осуще-

ствляют медленное охлаждение - 0,3 град/мин до температуры -35 0С. Следую-

щий этап -быстрое охлаждение до – 1960 С путем погружения в жидкий азот.

Защитный эффект при ступенчатом способе охлаждения связывают с тем, что имеется зависимость между скоростью охлаждения и образованием льда вне и

19

внутри клетки. При сравнительно медленном начальном охлаждении кристал-

лизация возникает вне клетки. Вода успевает выйти из клетки и замерзнуть вне её, тогда как при большой скорости охлаждения лёд образуется в самой клетке.

Оттаивание эмбрионов производят быстрым способом в один этап, чтобы из-

бежать рекристаллизации. Наиболее часто используют водяную баню при t 25-

37 0С.

Технология криоконсервирования эмбрионов. Для замораживания целесо-

образно использовать свежеприготовленные эмбрионы, так как хранение в ус-

ловиях бокса даже в течение 3 часов отрицательно влияет на их жизнеспособ-

ность. Перед замораживанием необходимо провести оценку эмбрионов. Для криоконсервирования используют только те эмбрионы, которые оценены на

«отлично» или «хорошо». Необходимые для работы рабочие растворы готовят в стерильных условиях в день применения. Среду для промежуточного хране-

ния эмбрионов используют как исходную для приготовления растворов глице-

рина и сахарозы.

Насыщение проводят одноступенчатым способом, который обычно ис-

пользуется на эмбрионах хорошего качества. При этом способе эмбрионы сразу же помещаются в этот раствор на часовом стекле и выдерживаются 15-20 ми-

нут. При использовании многоступенчатого способа эмбрионы последователь-

но помещают в растворы глицерина возрастающей концентрации, выдержива-

ют по несколько минут. Замораживают эмбрионы с помощью специальных программных замораживателей, принцип работы которых основан на посте-

пенном охлаждении эмбрионов в автоматическом режиме. Эмбрионы замора-

живают в специальных пробирках или ампулах ёмкостью 1 мл, а также в пла-

стиковых соломинках (паеттах). Для хранения замороженных эмбрионов ис-

пользуют жидкий азот, в качестве ёмкости - сосуды Дьюара объёмом 33 л.

Оттаивание происходит в водяной бане с температурой 25-37 0С до ис-

чезновения льда в контейнере с эмбрионами. Оттаявшие эмбрионы переносят на часовое стекло в растворе криопротектора, проводят предварительную мор-

фологическую оценку. Удаляют криопротектор, последовательно помещая их в

20