Задание 3. Качественные реакции на белки

Для качественного определения белков проводят следующие характерные реакции:

1. с нингидрином;

2. Адамкевича;

3. На содержание в белке серы.

Оборудование и реактивы: 0,1н р-р нингидрина, 20 % NaОН, 10 % уксуснокислый свинец, ледяная уксусная кислота, концентрированная серная кислота, пробирки, пипетки.

Ход работы. Белки, полипептиды и аминокислоты с нингидрином дают интенсивную синюю или фиолетовую окраску.

1. Реакция с нингидрином

2. Реакция Адамкевича является характерной реакцией на содержание в белке триптофана, который в кислой среде образует со многими альдегидами цветные продукты конденсации. Белок с глиоксилевой кислотой в присутствии крепкой серной кислоты образует продукт красно-фиолетового цвета. Глиоксилевая кислота образуется в ледяной уксусной кислоте.

3. Соединения, содержащие серу, такие как цистеин, глютатион, некоторые ферменты, играют исключительно большую роль в процессах дыхания, брожения, синтеза, ресинтеза. Повышение активности некоторых ферментов обусловлено наличием сульфгидрильных соединений, которые участвуют в окислительно-восстановительных процессах. При нагревании со щелочью аминокислоты и другие белковые вещества, содержащие серу, легко ее отщепляют в виде сероводорода, который с уксуснокислым свинцом дает черный осадок свинца.

Оборудование и реактивы:. 1. Для определения белковых веществ в растительных продуктах полученную белковую вытяжку разводят в 10 раз дистиллированной водой и к 2 мл этого раствора белка добавляют 0,5 мл 0,1 % р-ра нингидрина. Смесь окрашивается в фиолетовый цвет или фиолетово-розовый цвет, при стоянии смесь синеет.

Эту реакцию дают и аминокислоты. При определении их в пробирку наливают 1 мл раствора аминокислоты и добавляют 5 капель раствора нингидрина. При нагревании появляется фиолетово-синее окрашивание.

2. В пробирку наливают несколько капель белковой вытяжки и прибавляют около 1 мл ледяной СН₃СООН. Наклонив пробирку, осторожно (по стенке) приливают 1 мл крепкой Н₂SО₄ (d=1,84). На границе двух несмешивающихся жидкостей образуется красно-фиолетовое кольцо.

4. К испытуемому раствору белковой вытяжки приливают равный объем 20 % NaОН и несколько капель 10 % раствора свинца. Смесь осторожно (!) нагревают до кипения. Образовавшийся белый осадок вначале буреет, а затем чернеет, что указывает на содержание в белке серы.

Задание 4. Фракционирование белков сульфатом аммония

Освобождение белков из растворов солями называется высаливанием. Принцип высаливания заключается в следующем: молекула белка удерживается в растворе в следствие действия на нее стабилизирующих факторов: электрического заряда и водной оболочки (гидросферы). Соли щелочных и щелочеземельных металлов несут заряд, противоположный заряду белковой мицеллы, и обладают большей гидрофильностью, чем белок. Поэтому при добавлении соответствующего количества солей в раствор белка белковые молекулы теряют заряд и водную оболочку, т.е. оба стабилизирующих фактора, при этом дигидратированные белковые мицеллы выпадают в осадок. При уменьшении количества солей в растворе, что достигается диализом или разведением водой, белки могут вновь перейти в раствор. Для высаливания различных белков требуются разные количества одних и тех же солей, это позволяет высаливать белки по фракциям и таким образом разделять их.

Оборудование и реактивы: насыщенный раствор (NH₄)₂SO₄, измельченный в ступке, центрифуга, центрифужные пробирки.

Ход работы. В чистую пробирку наливают 5 мл белковой вытяжки и 5 мл насыщенного раствора (NH₄)₂SO₄, перемешивают. Оставляют на 5 мин., за это время выпадает осадок глобулина. Глобулин отделяют центрифугированием при 2500 об./мин. в течение 30 мин. Центрифугат, содержащий альбумин, насыщают порошком (NH₄)₂SO₄ до тех пор, пока не прекратится его растворение. Из насыщенного раствора выпадает в осадок альбумин, который отделяют центрифугированием при 2500 об./мин. в течение 15 мин. Прозрачный центрифугат испытывают на присутствие белков по биуретовой реакции; отрицательная реакция показывает полноту осаждения белков.