8 – положительный контроль ПЦР – ГМ кукуруза MON 810

Следует иметь в виду, что, кроме полос 194 п.н., 400 п.н., 544 п.н., в дорожках могут наблюдаться нечёткие размытые полосы праймердимеров, которые располагаются ниже уровня 100 н.п. (в нижней части дорожки).

Если специфическая полоса плохо выражена (значительно менее интенсивно, чем положительные контроли), то следует провести повторную ПЦР начиная с этапа амплификации. Если такой результат повторяется, то его считают сомнительным и проводят повторное исследование.

В случае получения различных результатов в параллельно анализируемых пробах следует повторить анализ с ещё одной навеской продукта.

При работе с материалом, содержащим большое количество ДНК, например продукты животного происхождения, в ПЦР участвует большое количество неспецифической геномной ДНК. При этом в геле появляются характерные шмеры, располагающиеся по дорожке равномерно или концентрирующиеся около лунки. На фоне шмера в положительном образце видна специфическая полоса. Большое количество геномной ДНК может ингибировать ПЦР (в дорожке отсутствует ожидаемая специфическая полоса), в этом случае рекомендуется переставить амплификацию данной ДНК-пробы, разведя её в 5 раз буфером для элюции.

Результаты анализа не учитываются, если:

1.В дорожке любого отрицательного контроля выявляется специфическая полоса (ложноположительный результат). Это возможно вследствие контаминации (загрязнения) реактивов, оборудования или проб. В этом случае следует обработать поверхности лабораторных столов

идозаторов (пипеток) раствором 1 М соляной кислоты, заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить амплификацию.

2.В дорожке любого положительного контроля специфические полосы отсутствуют (ложноотрицательный результат). Это возможно в случае потери активности одного из компонентов реакционной смеси ПЦР. Следует заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить амплификацию.

3.В дорожках появляются неспецифические полосы на разных уровнях. Возможные причины: неправильное проведение «горячего старта» или неверный температурный режим в ячейках амплификатора. В этом случае рекомендуется переставить ПЦР, начиная с этапа амплификации.

Обезвреживание реагентов, содержащих бромид этидия

118

Отработанные гели и буфер из камеры помещают в пластиковую ёмкость на 5 л с плотно завинчивающейся крышкой. На 1 л обезвреживаемых реагентов добавляют 1 л 0,5 М раствора калия перманганата и затем 1 л 2,5 М соляной кислоты. Аккуратно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 4 – 6 часов. Для нейтрализации добавляют 1 л 2,5 М натрия гидроксида, аккуратно перемешивают. Нейтрализованные реактивы сбрасывают в канализацию. Отработанный буфер можно дезактивировать с помощью стеклянной колонки ёмкостью на 1 – 2 л, заполненной активированным углем. Отработанный буфер пропускать через неё небольшими порциями. Дезактивированный раствор можно сливать в канализацию.

Методика количественного определения генно-инженерно- модифицированных организмов в растительном сырье и пищевых продуктах, содержащих сою или кукурузу

Методика основана на использовании тест-системы, разработанной ЦНИИ Эпидемиологии «АмплиКвант ГМ соя», и предназначенной для определения количественного содержания генетически модифицированной сои в пищевой продукции и кормах для животных методом полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме реального времени (Real Time PCR). Определение осуществляется на амплификаторах iCycler («Bio-Rad» (США)), ABI-PRISM 7000 («Applied Biosistems» (США)) или RotorGene 2000, 3000 («Corbett Research» (Австралия)).

Принцип тестирования заключается в проведении полимеразной цепной реакции с детекцией продуктов ПЦР в режиме реального времени c использованием зондов TaqMan.

Реакционная система включает две независимые системы для ПЦР (находящиеся в одной реакционной смеси), каждая из которых содержит праймеры и меченый флуоресцентными красителями зонд. С помощью первой системы выявляют последовательность ДНК-мишени, специфичной для ГМИ – в данном случае 35S промотор. Вторая представляет собой систему эндогенного контроля (ЭК), с помощью которой определяют ген, специфичный для сои (как трансгенной, так и нетрансгенной). Зонд системы ГМИ включает флуоресцентный краситель FAM. Зонд системы ЭК включает флуоресцентный краситель JOE. Система ЭК является ключевой для количественного анализа, а также позволяет определять присутствие ДНК сои в исследуемом образце.

Относительное количество ГМИ определяют с использованием калибровочной прямой, для построения которой при каждой постановке анализа тестируют калибровочные стандарты. В качестве калибровочных стандартов рекомендовано использовать сертифицированный материал – сертифицированные стандарты ГМИ, выпускаемые Институтом

119