Tomchuk_POSІB_VET_BІOHІMІJa

приблизно 25–50 см3 екстракту проби через фільтр (синя стрічка). Відібрати 10 см3 фільтрату (еквівалентно 1 г проби) до скляного шприца для пропускання через імуноафінну колонку.

Імуноафінна колонка має набути температури оточуючого середовища перед використанням. Для наступного етапу процедури потрібно зняти заглушку з дна колонки і пропустити отриманий

«закріплення» афлатоксинів на антитілах. Об’єм проби має бути 10 см3 при використанні екстракту з метанолом (еквівалентно 1 г оригінальної сировини).

Помістити 50 г мілко подрібненої проби та 25 г целіту в конічну колбу на 500 см3. Додати 250 см3 хлороформу та 25 см3 дистильованої або деіонізованої води, закрити пробкою та перемішувати протягом 30 хв. Профільтрувати через фільтр (синя стрічка) і зібрати 20 см3 фільтрату. Відібрати 10 см3 фільтрату і випарити до сухого осаду на роторному випаровувачі при 60 оС. Осад розчинити в 5 см3 метанолу і довести об’єм до 50 см3 дистильованою водою. Перемістити весь розчин (еквівалентний 2,0 г проби) в ємність скляного шприца для пропускання через колонку.

Імуноафінна колонка має набути температури оточуючого середовища перед використанням. Для наступного етапу процедури потрібно зняти заглушку з дна колонки і пропустити отриманий об’єм проби крізь імуноафінну колонку зі швидкістю потоку десь 2– 3 дм3/хв. Повільний постійний тиск є значним фактором для «закріплення» афлатоксинів на антитілах. Об’єм проби має бути 50 см3 при використанні екстракту з хлороформом (еквівалентно 2 г проби).

Додати 20 см3 PBS (рН 7,2) в ємність скляного шприца і пропустити через імуноафінну колонку зі швидкістю потоку 5 см3/хв.

Помістити віалу прямо під колонкою. Набрати 1 см3 метанолу для хроматографії (елюент) в скляний шприц. Елюювати афлатоксини з колонки в скляну віалу пропусканням метанолу крізь колонку зі швидкістю потоку 1 крапля в секунду. Рекомендується повторення проходження потоку крізь колонку (зміна напрямку потоку) тричі, щоб відбулася повна денатурації моноклональних антитіл і послідовному звільненні афлатоксинів у розчин. Наступний етап елюювання – набрати 1 см3 дистильованої води в ємність скляного шприца, пропустити крізь колонку та зібрати у віалу до

111

загального об’єму 2 см3 після чого аналізують на високоефективному рідинному хроматографі з флуорисцентним детектором.

Проведення розрахунків

р= (С*2)/1000)*1000, де

С– концентрація афлотоксинів В1, В2, G1, G2 в пробі, нг/дм3; 2 – коефіцієнт перерахунку згідно методики;

1000 – коефіцієнт перерахунку з нанограмів в мікрограми;

1000 – коефіцієнт перерахунку на мкг/кг.

112

ДОДАТОК ПРИГОТУВАННЯ РЕАКТИВІВ

1. Приготування 0,5 н. спиртового розчину калію гідроксиду –

35 г калію гідроксиду розчиняють в 20 см3 дистильованої води та додають 1 дм3 етилового спирту, залишають на добу для відстоювання в зачиненій колбі. Потім переносять у темну тару.

2.Приготування 0,5 н. водного розчину гідрохлоридної кислоти

–41,25 см3 НСl (d = 1,19) доводять до 1000 см3 дистильованою водою.

3.Приготування 1 % спиртового розчину фенолфталеїну або тимолфталеїну – 1 г фенолфталеїну або тимолфталеїну розчиняють

в 100 см3 етилового спирту, ретельно перемішуючи. Зберігають в темному місці.

4.Приготування безбарвного розчину калію йодиду з масовою часткою 10 %. 10 г калію йодиду розчиняють в 100 см3 дистильованій воді.

5.Підготовка 1% водного розчину крохмалю – 1 г розчиненого крохмалю розтирають в ступці до кашоподібного стану з 3–5 см3

дистильованої водою. Приготовлену суміш додають до 100 см3 киплячої води та кип’ятять протягом 2 хв. Після охолодження розчин повинен бути прозорим. Для збільшення стійкості при зберіганні до отриманого розчину крохмалю додають 0,12–0,13 г саліцилової кислоти.

6. Приготування 0,1 н. спиртового розчину калію гідроксиду –

наважку калію гідроксиду масою 5,611 г переносять у мірну колбу на 1000 см3, розчиняють в етиловому спирті та доводять об’єм до мітки спиртом.

Коефіцієнт поправки спиртного розчину калію гідроксиду

встановлюють за розчином сульфатної кислоти концентрації с (1/2 H2SO4) = 0,1 моль/дм3.

Для цього в колбу наливають 20 см3 сульфатної кислоти, додають 2 краплі фенолфталеїну та титрують 0,1 н. розчином калію гідроксиду до легко-помітного рожевого забарвлення. Об’єм розчину сульфатної кислоти, розраховується як середнє арифметичне результатів трьох визначень.

Коефіцієнт поправки розчину калію гідроксиду (К) розраховується за формулою:

113

25 г натрію сіркуватистокислого розчиняють в 400 см3 води, додають 10 см3 ізобутилового спирту, ретельно перемішують, доводять об’єм до 1 дм3.

2) розчин натрію тіосульфату зі фіксаналів готують наступним чином:

Теплою водою змивають напис на ампулі і добре її обтирають. У мірну колбу місткістю 1 дм3 ставляють спеціальну воронку, в яку вкладений скляний бойок, гострий кінець якого повинен бути звернений угору. Коли бойок буде правильно укладений у воронці, ампулі з речовиною дають вільно падати так, щоб тонке дно ампули розбилося під час удару об гострий кінець бойка. Після цього пробивають верхнє поглиблення ампули і весь її вміст обережним струшуванням висипають у колбу. Ампулу, не змінюючи її положення, промивають дистильованою водою. Після цього видаляють, а розчин доливають дистильованою водою до мітки, закривають колбу пробкою і обережно ретельно перемішують до повного розчинення речовини. Розчин придатний до застосування через 10– 14 діб. Зберігається у склянці з темного скла на протязі 1 місяця.

Після закінчення терміну зберігання необхідно визначити поправку до номінальної концентрації розчину натрію тіосульфату. Якщо величина поправки становить не менше ніж 0,9, розчин може бути використаний.

Якщо під час зберігання з’являються пластівці або осад, розчин не треба застосувати.

Визначення поправки до номінальної концентрації розчину натрію тіосульфату.

0,15–0,20 г калію двохромовокислого додають до конічної колби на 500 см3 з пришліфованою пробкою, розчиняють в 50 см3 води. До розчину додають 10 см3 розчину калію йодистого (з масовою часткою 30 %), 20 см3 розчину сульфатної кислоти (з масовою часткою 20 %), зачиняють колбу пробкою, що оброблена розчином калію йодиду, ретельно перемішують та витримують в темному місці протягом 10 хв. Потім додають до колби 200 см3 води, а йод, що утворився, титрують з бюретки приготовленим розчином натрію тіосульфату до зміни забарвлення розчину у жов-тий колір, потім додають 2 см3 розчину крохмалю та продовжують титрування при ретельному перемішуванні до зміни забарвлення синього кольору розчину в світло-зелений.

115

Концентрацію розчину натрію тіосульфату розраховуємо за формулою:

c = m/{M((1/6)K2Cr2O7)·V},

де с – концентрація розчину тіосульфату, моль/дм3; m – маса наважки K2Cr2O7, г;

M((1/6)K2Cr2O7) = 49,031 г/моль – молярна маса еквіваленту калію дихромату;

V – об’єм розчину тіосульфату, дм3, витрачений на титрування наважки.

11. Приготування 0,5 % водного розчину крохмалю – 0,25 г

крохмалю розчиняють в 10 см3 води до розчинення. До 40 см3 води, яка нагрітою до 60–70 °С, додають при ретельному перемішуванні крохмальну суміш та доводять розчин до кипіння.

12. Приготування розчину натрію бромистого та брому в метиловому спирті (розчин Кауфману) – 140 г натрію бромистого розчиняють в 1 дм3 метанолу. Розчин ретельно перемішують і залишають на 24 год, періодично перемішуючі. Після закінчення зазначеного терміну розчин фільтрують через фільтр, у прозорий розчин додають 5,1 см3 брому і ретельно перемішують. Через 10–15 хв розчин готовий до використання.

13. Очищення йоду. До 10 г йоду додають 1 г калію йодиду і 2 г прожареного кальцію оксиду. Суміш швидко розтирають у чистій ступці і переносять у чисту. Добре висушену склянку. Зверху склянку закривають чистою круглодонной колбою, зовні зовсім сухою, але наповненою холодною водою для кращого охолодження. Склянку злегка нагрівають, йод у цьому разі сублімується та осідає на дно колби у вигляді кристалів. Після охолодження склянки колбу знімають та зчищають чистою скляною паличкою кристали йоду в склянку.

14. Приготування натрію бромистого. Натрій бромистий висушують у сушильній шафі за температури 130 ˚С до порошкоподібного стану, періодично перемішуючи його. Після охолодження порошок використовують до готування розчину Кауфману.

3.Приготування безбарвного розчину калію йодиду з масовою часткою 10 %.

10г калію йодиду розчиняють в 100 см3 дистильованій воді.

4.Приготування окису алюмінію (лужна) – у колбі об’ємом на

200 см3 змішують 75 г окису алюмінію для хроматографії (100–

325 меш) з 75 см3 2 н. спиртового розчину їдкого калію, підігріва-

116

ють на водяній бані 15 хв при температурі 80 °С і охолоджують. Потім фільтрують відсмоктуванням, сушать при 130 °С і зберігають

угерметично закритій колбі.

5.Приготування реактиву Ніелда – беруть 22 г сурми трихло-

ристої і заливають 100 см3 хлороформу. З отриманого розчину готують 2-% розчин ацетилхлориду. Через 3 доби реактив готовий до вживання.

117

РЕКОМЕНДОВАНА ЛІТЕРАТУРА

6. Аналітичні методи досліджень. Спектроскопічні методи аналізу: теоретичні основи і методики: навч. посібник для підготовки студентів вищих навчальних закладів / Д. О. Мельничук, С. Д. Мельничук, В. М. Войціцький [та ін.]: за ред. Д. О. Мельничука. – К.: ЦП «Компринт», 2016. – 289 с.

7. Аналітичні методи досліджень. Хроматографічні та електрофоретичні методи аналізу: теоретичні основи і методики: навч. посібник для підготовки студентів вищих навчальних закладів / В. М. Войціцький, С. В. Хижняк, В. А. Грищенко [та ін.]. – К.: ЦП «Компринт», 2017. – 268 с.

3. AFLAPREP® Application of immunoaffinity columns for sample clean-up prior to HPLC analysis for aflatoxins (AFLAPREP®

Застосування імуноафінних колонок для очистки зразків для визначення вмісту афлатоксинів методом високоефективної рідинної хроматографії).

4.Агасян П. K. Кулонометрический метод анализа / П. K. Агасян, Хамракулов Т.К.. – М., 1984. – 176 c.

5.Агасян П. К. Основы электрохимических методов анализа. Потенциометрический метод / П. К. Агасян, Е. Р. Николаева – М.,

1986. – 176 c.

6.Айвазов Б. В. Основы газовой хроматографии / Б. В. Айвазов. – М.: «Высшая школа», 1990. – 215 с.

7.Аналитическая химия. Проблемы и подходы. В 2 кн. / Под

ред. Р. Кельнера, Ж.-М. Мерме, М. Отто, М. Видмера. – М.: Мир,

2004. – 320 с.

8.Гайдукевич О. М. Аналітична хімія / О. М. Гайдукевич, В. В. Болотов та ін. – Харків «Основа», 2000. – С. 358–368.

9.Голицын В. М. Неденатурирующий электрофорез. Фракционирование фотосинтетических пигмент-белковых комплексов и белков плазмы крови / В. М. Голицын // Биохимия. – 1999. – Т. 64. –

С. 64–70.

10.ГОСТ 13586.3-83 Зерно. Правила приемки и методы отбора

проб.

11.ГОСТ 8285-91 Жиры животные топленные. Правила при-

емки и методы испытания.

12. ГОСТ Р 51445-99 Жиры и масла животные. Метод определения показателя преломления.

118

13.ДСТУ 4350:2004 Олії. Метод визначення кислотного

числа.

14.ДСТУ 4463:2005 Маргарини, жири кондитерські та для молочної промисловості.

15.ДСТУ 4569:2006 Жири тваринні і рослинні та олії. Методи визначення йодного числа.

16.ДСТУ 5508-2001 Жири та олії тваринні і рослинні. Аналізування методом газової хроматографії метилових ефірів жирних

кислот.

17.ДСТУ 5509-2002 Жири та олії тваринні і рослинні. Приготу-вання метилових ефірів жирних кислот.

18.ДСТУ EN 12955 – 2001 Визначення вмісту афлатоксину-В1

та суми афлатоксинів В1, В2, G1 та G2 в зернових культурах, фруктах з твердою шкіркою та похідних від них продуктах. Метод високоефективної рідинної хроматографії за допомогою постколо - нкової дериватизації та очищення на імуноафінній колонці.

19.ДСТУ ISO 11885:2005 Якість води. Визначання 33 елементів методом атомно-емісійної спектрометрії з індуктивно-зв’язаною плазмою.

20.ДСТУ ISO 13690:2003 Зернові, бобові та продукти їх помелу. Відбирання проб

21.ДСТУ ISO 3961:2004 Жири тваринні і рослинні та олії. Визначення йодного числа.

22.ДСТУ ISO 6320-2001 Жири тваринні і рослинні та олії. Визначення показника заломлення.

23.Дубініна А. А. Токсичні речовини у харчових продуктах та методи їх визначення: Підруч. / А. А. Дубініна, Л. П. Малюк,

Г. А. Селютына [та ін.]. – К.: «Видавничий дім «Професіонал»,

2007. – 384 с.

24.Золотов Ю. А. Основы аналитической химии. В 2 кн. Учеб. для вузов / Ю. А. Золотов, Я. Н. Дорохова, Фадеева [и др.]: под ред. Ю. А. Золотова – М.: Высшая школа, 2002. – 351 с.

25.IRIS спектрометр с индуктивно-связанной плазмой, руководство по эксплуатации спектрометра.

26.Коренман Я. И. Практикум по аналитической химии. Хроматографические методы анализа: Учебное пособие / Я. И. Корен-

ман. – Воронеж, 2000. – 336 с.

119

27. Кучеренко Н. Е. Современные методы биохимических исследований / Н. Е. Кучеренко, Ю. Д. Бабенюк, В. М. Войцицкий. – К.: Фитосоциоцентр, 2001. – 424 с.

28.Харитонов Ю.Я. Аналітична хімія. Кн. 2. / Ю. Я. Харитонов. – М.: Вища школа, 2003. – 345 с.

29.Чмиленко Ф. О. Методи атомної спектроскопії: атомно-аб-

сорбційний спектральний аналіз / Ф. О. Чмиленко, Т. М. Деркач. –

Дн-ск: РВВ ДНУ, 2002. – 120 с.

120