Tomchuk_POSІB_VET_BІOHІMІJa

трифуги (з фактором розділення більше 3 500). Звичайні центрифуги використовуються, як правило, для розділення низькодисперсних (відносно великі розміри частинок – діаметр більше 10–50 мкм) суспензій різної концентрації.

Загальний вигляд настільної звичайної центрифуги наведений на рис. 2.14а.

а б Рис. 2.14. Загальний вигляд настільної звичайної центрифуги (а) і уль-

трацентрифуги (б)

Суперцентрифуги використовуються в основному для розділення емульсій і високодисперсних суспензій (величина частинок менше 10 мкм). Для розділення високодисперсних систем і високомолекулярних сполук використовуються ультрацентрифуги з фактором розділення більше 100 000. Загальний вигляд ультрацентрифуги наведений на рис. 2.14, б.

Припаративні ультрацентрифуги використовуються для виді-

лення речовин з розчинів, які в звичайних умовах знаходяться в колоїдному стані або у вигляді нерозділених суспензій (білки, полісахариди, нуклеїнові кислоти та ін.).

Основні види препаративного ультрацентрифугування: диферен-

ціальне, зонально-швидкісне і рівноважне.

В основі диференціального (роздільного) центрифугування ле-

жить почергове, роздільне осадження частинок макромолекул. Воно базується на різниці швидкості седиментації частинок в суміші, які відрізняються одна від одної розмірами та щільністю. Це досягається шляхом ступінчатого збільшення центробіжного прискорення. В результаті первісного центрифугування отримують фракцію (осад) важких частинок, яку суспендують в розчині та знову центрифугують при більшому, ніж попередньому, центробіжному прискоренні. Цю процедуру повторюють декілька разів до отримання в осаді необхідних

91

частинок (макромолекул). В свою чергу, центрифугування надосадкової рідини при більших швидкостях або протягом тривалого часу приводить до осадження частинок (макромолекул), які мали середні або малі розміри і не випадали в осад при первинному (або наступному за ним) центрифугуванні (рис. 2.15).

Рис. 2.15. Послідовність операцій при диференційному (роздільному) центрифугуванні

Загально-швидкісне центрифугування полягає в тому, що час-

тинки (макромолекули), щільність яких значно більша за густину середовища, розділяються за швидкістю седиментації. При цьому осад не утворюється, а частинки (макромолекули) різних розмірів зосереджуються в дискретних шарах (смугах) – відбувається зональне розмежування. Для того, щоби шари смуги під час центрифугування не змішувалися і були вузькими, створюють градієнт густини середовища вздовж радіуса обертання в напрямку від центра до периферії.

Вибір того чи іншого градієнта визначається конкретними задачами центрифугування. Для його створення використовують розчини різної концентрації (густини) сахарози, гліцерину, метризаміду, фіколу та ін. Найчастіше використовується сахароза з фіксованим рН, оскільки вона не взаємодіє з більшістю хімічних речовин і дає можливість застосовувати спектроскопічні методи аналізу. Залежність густини і в’язкості сахарози від її концентрації наведена в табл. 2.2.

Гліцерин посилює стабільність білків, у тому числі ферментів; метризалін (похідне трийодбензонної кислоти) не впливає на ступінь гідратації біополімерів, тобто забезпечує їх стійкість; розчини фіколу мають значну, порівняно з сахарозою, в’язкість.

92

Аналітичне центрифугування використовується для розділення емульсій та тонкодисперсних суспензій, вивчення седиментаційних властивостей речовин, визначення молекулярної маси речовин тощо.

Аналітичні центрифуги, як вже відмічалося, можуть розвивати швидкість до 70 000 об/хв, при цьому створювати центробіжне прискорення до 500 000g. Ротор в них, як правило, має еліпсоподібну форму і насаджується на вал електродвигуна за допомогою спеціальної струни, що дозволяє змінювати швидкість його обертання.

Визначення молекулярних мас макромолекул проводять, як правило, трьома методами аналітичного ультрацентрифугування:

1.Визначення молекулярної маси по швидкості седиментації.

Воснові цього методу лежить переміщення макромолекул, які були

спочатку рівномірно розподілені по всьому об’єму, по радіусу від центра обертання. Між областю розчинника, яка звільняється від макромолекул, а також тією його частинкою, що їх містить, утворюється чітка межа розподілу. Ця межа при центрифугуванні переміщується, що дає можливість визначити швидкість седиментації макромолекул, за якою визначається за рівняннмя Сведберга молекулярна маса (М) макромолекул:

М = STR P(1 -Vρ )

де S – коефіцієнт седиментації макромолекули; R – газова стала; Т – абсолютна температура; Р – коефіцієнт дифузії макромолекули; V – парціальний питомий об´єм (об’єм, який займає 1 г розчинених макро-молекул); ρ – густина розчинника .

2. Метод седиментаційної рівноваги базується на тому, що при відносно невеликих швидкостях центрифугування (7 000–8 000 об/хв) можна досягнути такого стану, що макромолекули не осаджуються, а під дією центробіжних сил з одного боку і дифузних з іншого боку досягається рівноваги, тобто макромолекули перестають переміщуватися. Молекулярну масу макромолекул розраховують по утвореному градієнту концентрації наступним чином:

94

де R – газова стала; Т – абсолютна температура; V – парціальний питомий об’єм; ρ – густина розчинника; С1 і С2 – концентрація макромолекул на відстані R1 i R2 від вісі обертання ротора; w – кутова швидкість.

3. Метод наближення до седиментаційної рівноваги базується на тому, що молекулярна маса макромолекул визначається в стані наближеної рівноваги. Спочатку при ультрацентрифугуванні макромолекули розподіляють по всьому об’єму пробірки рівномірно, а потім по мірі центрифугування макромолекули осідають і густина розчинна зверху пробірки (меніска) поступово зменшується. Зміну густини реєструють, і з її урахування визначають молекулярну масу макромолекул наступним чином:

де Мм і МD – величина молекулярної маси, яка визначена за розділенням концентрації макромолекул в меніску та дні пробірки, відповідно: R – газова стала; Т – абсолютна температура; V – парціальний питомий об’єм; ρ – густина розчинника; dc/dr – градієнт концентрації макромолекул; Rм і RD – відстань до меніска і дна пробірки, відповідно; См і СD – концентрація макромолекул в меніску і на дні пробірки, відповідно.

Визначення молекулярної маси макромолекул може бути застосовано для оцінки чистоти цих макромолекул.

Лабораторна робота 2.1. Визначення кислотного числа титрометричним методом з візуальною індикацією

Кислотне число – фізична величина, яка дорівнює масі калію гідроксиду в мг, що необхідна для нейтралізування суми вільних жирних кислот та інших супутніх триацилгліцеролам речовин, які нейтралізуються лугом, що міститься в 1 г олії.

Суть методу полягає в розчинені певної маси жиру чи олії в суміші розчинників із подальшим титруванням вільних жирних кислот водним чи спиртовим розчином калію або натрію гідроксиду.

Матеріал для дослідження: жири тваринні і рослинні та олії.

95

Устаткування, реактиви, лабораторний посуд і матеріали:

ваги лабораторні 2-го класу точності з межею зважування 200 г; баня водяна; колби конічні на 100 і 250 см3; циліндри вимірювальні на 50 см3; бюретки на 2 см3, 5, 25 см3; діетиловий етер; спирт етиловий; фенолфталеїн, спиртовий розчин з масовою часткою 1 %; 0,1 н. спиртовий розчин калію гідроксиду.

Хід роботи:

Дослідну пробу ретельно перемішують та необхідну кількість (г), опираючись на дані табл. 2.3, вміщують у суху конічну колбу

250 см3.

Таблиця 2.3. – Параметри зважування

Додають 50 см3 нейтралізованої суміші розчинників (суміш діетилового етеру і етилового спирту в співвідношенні 2:1) та ретельно перемішують (для забарвлених олій кількість розчинників можна збільшувати до 150 см3).

Отриманий розчин при постійному перемішуванні швидко титрують 0,1 н. розчином калію гідроксиду до отримання слабкорожевого забарвлення, яке стійке протягом 15–30 с. При кислотному числі олії більше 6 мг КОН/г беруть наважку олії не більше 1–2 г та розчиняють її в 40 см3 нейтралізованої суміші розчинників.

У разі кислотного числа менш 2 мг КОН/г титрування проводять з мікробюретки. Метод використовується в діапазоні від 0,1 до 30 мг КОН/г проби.

Проведення розрахунків:

Кислотне число (Х), мг КОН/г, розраховують за формулою:

,

96

m – маса проби, г;

V – об’єм 0,1 н. розчину калію гідроксиду, який пішов на титрування проби, см3;

К – поправка до титру 0,1 н. розчину калію гідроксиду (К=1); 5,611 – коефіцієнт, що дорівнює значенню розрахункової олії

КОН в 1 см3 0,1 н. розчину КОН.

За кінцевий результат беруть середнє арифметичне двох паралельних визначень. Визначення проводять до другого знаку після коми (табл. 2.4).

Розбіжність між результатами двох паралельних визначань не повинна перевищувати такого значення: α = 0,06+0,01·Х·(Х – серед-

нє арифметичне результатів двох паралельних визначень, мг КОН/г).

Таблиця 2.4. Параметри кислотності рослинних олій

Для характеристики кислотності рослинних олій, крім кислотного числа, дуже часто розраховують відсотковий вміст вільної олеїнової кислоти за формулою:

О = к.ч. · 0,53 к.ч. – кислотне число, мг Примітка. Спиртово-етерна суміш може бути замінена на

спиртово-хлороформну (1:1). При цьому для аналізу слід використовувати водний 0,1 н. розчин калію гідроксиду.

Лабораторна робота 2.2. Визначення йодного числа (метод Кауфмана)

Йодне число є найважливішим хімічним показником. Цей показник дозволяє судити про міру ненасиченості жирних кислот, що входять до складу жиру. Чим вище вміст ненасичених жирних кислот, тим вище значення йодного числа.

97

Йодне число жиру – умовна величина, що є кількістю грамів йоду, еквівалентна кількості галогену, що приєднався до 100 г дослідного жиру, виражена у відсотках йоду.

Метод заснований на обробленні дослідної проби для насичення подвійних зв’язків розчинником та розчином галогеновмісних сполук (розчин Кауфмана). Під час подальшого оброблення калію йодидом йод, що виділяється, титрують розчином натрію тіосульфату. Метод визначення кислотного числа в рослинних оліях в діапазоні від 10 до 200 г I2/100г.

Матеріал для дослідження: жири тваринні, рослинні та олії.

Устаткування, реактиви, лабораторний посуд і матеріали:

ваги лабораторні 2-го класу точності з найбільшою межею зважування 200 г; колби конічні на 500 см3; піпетки на 10 см3; склянка низька з носиком на 250 см3; бюретка на 50 см3; піпетки на 10, 20 см3; колби мірні на 100 см3; циліндри мірні на 50, 100 см3; крапельниці 1–50 згідно ГОСТ 25336; воронки лабораторні; натрій сіркуватистокислий 5-водний, водний розчин концентрації 0,1 моль/дм3; метанол; кальцію оксид; натрій бромистий; бром згідно з ГОСТ 4109, х.ч.; калію йодид, безбарвний розчин 10 %; натрій вуглекислий безводний; йод, згідно ГОСТ 4159, ч.д.а.; хлороформ: крохмаль розчинений, водний розчин з масовою часткою 1 %; папір фільтрувальний.

Хід роботи

Пробу ретельно перемішують, якщо потрібно профільтровують. У конічну колбу з пришліфованою пробкою вносять пробу, масу якої визначають згідно з табл. 2.5 залежно від передбачуваного значення йодного числа. Проби зважують на лабораторних вагах 2-го класу із записом результату до четвертого десяткового знаку.

Таблиця 2.5. Значення йодного числа

98

Наважку в колбі розчиняють у 10 см3 хлороформу. З бюретки доливають 20 см3 розчину Кауфмана. Колбу з реакційною сумішшю закривають пробкою, обережно перемішують вміст обертами і ставлять у темне місце за температури близько (20±5) ˚С для настоювання. Час настоювання встановлюють залежно від передбачуваної величини йодного числа:

Для олій та жирів з йодним числом менше ніж 100 – 1 год; Для олій та жирів з йодним числом більше ніж 100 – 1,5 год.

Після закінчення зазначеного часу до колбу доливають піпеткою від 10 до 15 см3 розчину калію йодиду і від 50 до 60 см3 дистильованої води.

Йод, що виділився, титрують розчином натрію тіосульфату (0,1 моль/дм3) до одержання соломино-жовтої забарвленості. Після цього додають від 1 до 2 см3 водного розчину крохмалю з масовою часткою 1 % і продовжують титрувати до повного зникнення синьої забарвленості. Одночасно в тих самих умовах ставлять контрольне випробування (без наважки проби).

Проведення розрахунків:

Йодне число (Х) у відсотках йоду, розраховують за формулою:

, m – маса олії або жиру, г;

0,01269 – маса йоду в г, яка еквівалентна 1 мл розчину натрію тіосульфату С(1/2 Na2S2O3) = 0,1 моль/дм3;

К – поправка до масової концентрації розчину натрію тіосульфату С(Na2S2O3) = 0,1 моль/дм3;

За кінцевий результат беруть середнє арифметичне двох паралельних визначень. Розбіжність між паралельними визначеннями не повинна перевищувати 1 % від величини йодного числа.

99