- •Актуальность применения культур клеток в различных областях биологии, медицины и сельского хозяйства
- •Роль клеточных культур в биотехнологии при производстве биологически активных веществ, белков, ферментов, аминокислот, гормонов, вакцин и др.;
- •Применение клеточных культур для диагностики и лечения наследственных заболеваний.
- •Применение клеточных культур в качестве тест-объектов при испытании новых фармакологических веществ.
- •Применение клеточных культур для сохранения генофонда исчезающих видов животных и растений.
- •Аппараты для очистки воды, используемой для приготовления питательных сред или мытья культуральной посуды. Их характеристика и возможности получения сверхчистой и общелабораторной воды.
- •7. Приборы, аппараты и реактивы для мытья и стерилизации посуды.
- •8. Приборы для дозирования, разведения и пробоотбора.
- •9. Боксовые помещения и ламинар-боксы. Их типы, обустройство и значение.
- •10. Лабораторные термостаты. Специальные требования, предъявляемые к лабораторным термостатам для культивирования клеток, и типы их конструкций.
- •12. Лабораторные ферментеры. Их назначение, типы, конструкция и области применения.
- •13. Глубинное культивирование клеточных и бактериальных культур.
- •14. Общая модель динамики роста клеточных культур.
- •15. Специфические особенности работы с ферментерами. Проблемы пенообразования и пеногашения.
- •16. Специфические особенности работы с ферментерами. Хемостаты и турбидостаты.
- •17,18. Культуральная посуда. Особые требования к свойствам поверхности и материала изделий из стекла и пластика, предназначенных для роста клеток в монослое.
- •19. Области применения стеклянной и пластиковой посуды. Основные подходы, способы и степень подготовки культуральной посуды к культивированию клеток.
- •20. Принципы составления питательных сред.
- •21. Устройства для приготовления питательных сред.
- •22. Основные требования, предъявляемые к питательным средам для клеточных культур.
- •23. Установки для стерилизующей фильтрации жидких питательных сред. Микро- и ультрафильтрация питательных сред.
- •24. Основные типы и состав питательных сред для культивирования различных типов клеток.
- •25. Основные питательные потребности клеток
- •26. Преимущества и недостатки разных типов питательных сред
- •27. Историческое развитие культивирования микроорганизмов. Работы л.Пастера, р.Коха и др. По созданию методов культивирования и изучению питательных потребностей микроорганизмов
- •28. Методы выделения чистых культур аэробных и анаэробных микроорганизмов
- •1) Механическое разобщение
- •29. Питательные среды для культивирования микроорганизмов
- •30. Динамика роста клеточных культур микроорганизмов
- •31. Подбор состава культуральных сред с учетом типов питания культивируемых микроорганизмов.
- •32. Влияние условий культивирования на жизнедеятельность микроорганизмов.
- •33. Потребность в кислороде и аэрация. Культивирование анаэробных микроорганизмов.
- •34. Динамика роста культуры микроорганизмов и характерные особенности каждой фазы.
- •35. Параметры роста: скорость роста, урожай клеток, время генерации, длительность лаг-фазы, экономический и метаболический коэффициенты и др.
- •36. Особенности культивирования бактериальных, дрожжевых и грибных клеток.
- •37. Динамическое и статическое (стационарное) культивирование.
- •38. Открытые и закрытые системы культивирования.
- •39.Поверхностное и глубинное культивирование, суспензионные культуры.
- •40.Периодический, продлённый периодический, многоциклический и непрерывный процессы культивирования клеток микроорганизмов
- •41.Методы создания и биологические свойства синхронных культур микроорганизмов.
- •42.Управляемое культивирование микроорганизмов с заданными свойствами.
- •43, 44. История создания культур клеток растений. Значение работ немецких ученых х.Фехтинга, к.Рехингера, г.Габерландта. Опыты Роббинса и Котте.
- •45. Методы создания клеточных культур растений
- •46. Получение культуры каллусных клеток.
- •47. Среды и методы выращивания каллусных клеток: поверхностный способ на агаризованной питательной среде.
- •48. Суспензионные культуры и глубинное культивирование, культивирование отдельных (одиночных) клеток.
- •49. Динамика роста популяции растительных клеток и особенности каждой фазы
- •50. Протопласты растительных клеток.
- •51. Способы выделения растительных протопластов и условия культивирования протопластов.
- •53. История и проблемы развития культивирования животных клеток. Основные культивируемые элементы.
- •54. Возможности и способы получения и особенности существования первичных культур.
- •55. Значение и возможности использования культивируемых животных клеток.
- •56. Особенности поведения и развития нормальных, трансформированных и опухолевых клеток.
- •57. Монослойные и суспензионные клеточные культуры. Типы культуральных систем для непроточных и проточных культур.
- •58. Выбор питательных сред и субстратов для культивирования животных клеток.
- •59. Состав питательных сред (среды, содержащие сыворотку, и бессывороточные питательные среды). Значение сывороточных компонентов.
- •60. Динамика развития клеточных линий и влияние физических, химических и биологических факторов.
16. Специфические особенности работы с ферментерами. Хемостаты и турбидостаты.
Всю совокупность операций по подготовке оборудования и коммуникаций с целью создания в них асептических условий можно разделить на два важнейших процесса: стерилизация внутренних полостей и герметизация всех элементов и узлов.
Культивирование по принципу хемостата – автоматическое культивирование, которое определяется скоростью разбавления, та скорость с которой подаётся субстрат. Скорость разбавления должна соответствовать скорости получения продукта. При хемостатном культивировании саморегулированная система возникает из-за: если первоначальное поступление свежей питательной среды и вымывание биомассы превышает скорость деления клеток; увеличивающая популяция начинает активнее выедать субстрат, что приводит к торможению роста культуры. Конечным итогом этих процессов является установление равновесия между скоростью роста культуры и её разбавлением. Биореактор работающий в таком режиме называется хемостатом.
Хемостатные биореакторы включают следующие конструктивные элементы: ферментер, оснащенный устройствами перемешивания и аэрирования среды, с-мой теплообмена; устройство подачи питательной среды; выпускное приспособление для оттока культуральной жидкости; систему контроля скорости протока среды, основанную на поддержании в режиме автоматического регулирования постоянного уровня или массы (объема) жидкости в емкостном аппарате.
Турбидостатные реакторы отличаются от хемостатных системой контроля скорости протока среды. Наиболее распространен контроль концентрации биомассы в реакторе, основанный на измерении светорассеяния культуральной жидкости на выходе из аппарата с помощью фотоэлемента. Также концентрация клеток может оцениваться по косвенным параметрам: рН, титруемой кислотности, убыли концентрации субстрата, приросту концентрации специфических метаболитов.
Хемостатные и турбидостатные биореакторы используют при различных скоростях разбавления среды, роста клеток. Хемостатный режим культивирования эффективен при малых скоростях протока, когда концентрация клеток незначительно изменяется даже при относительно больших перепадах концентрации в среде лимитируемого субстрата. Турбидостатный режим применяют при высоких скоростях разбавления, когда происходит резкое изменение концентрации клеток в среде в ответ на изменение скорости протока жидкости через биореактор.
Турбидостатный метод культивирования применяют для селекции быстрорастущих видов, получения штаммов, устойчивых к антибиотикам.
Виды систем хемостат: 1.оксистат (уровень кислорода в среде), 2.нутристат (концентрация питательного субстрата), 3.термостат (поддержание температурного режима), 4. pH- стат.
17,18. Культуральная посуда. Особые требования к свойствам поверхности и материала изделий из стекла и пластика, предназначенных для роста клеток в монослое.
Основная часть ассортимента специальной культуральной посуды предназначена для роста клеток в монослое, что определяет особые требования к свойствам поверхности и материала изделий как из стекла, так и из пластика. Для культивирования клеток обычно используют флаконы, колбы, матрасы, чашки Петри, платы, роллерные сосуды, пробирки, пипетки и т. д.
Посуда из стекла
Хотя в последние годы широко применяется пластиковая посуда одноразового использования, посуда из стекла не утратила своего значения благодаря ряду бесспорных преимуществ:
хорошие адгезионные (прикрепление клеток к субстрату) свойства поверхности, способствующие прикреплению клеток;
многократность использования;
биологическая инертность стекла ряда составов;
термостойкость и другие.
Кроме того, в экспериментах с контролируемым уровнем кислорода необходимо пользоваться именно стеклянной посудой, т. к. в пластике кислород может растворяться. Помимо этого из пластика могут экстрагироваться водорастворимые органические соединения.
Для стеклянной лабораторной и культуральной посуды на практике в основном применяются два типа составов - многощелочное и малощелочное боросиликатное стекло типа «Пирекс». Щелочесодержащие силикатные стекла имеют недостаточную термостойкость и химическую устойчивость к воде, кислотам и щелочам. Алюмоборосиликатные малощелочные стекла типа «Пирекс» характеризуются высокой устойчивостью к воде, устойчивостью к щелочным растворам и ко всем кислотам, за исключением плавиковой (фтористоводородной) и горячей фосфорной. Кроме того, стекла типа «Пирекс» обладают хорошими оптическими свойствами.
Существует также группа макропористых стекол, которые не используются для изготовления посуды, но применяются при культивировании клеток в качестве микроносителей.
Однако успех в эксперименте обеспечивается не только качеством стекла, но и степенью подготовки лабораторной посуды. Посуда для культивирования должна быть чистой физически, химически и бактериологически.
Пластиковая посуда
При работе с культурами клеток пластиковая посуда в отдельных случаях более пригодна из-за характерных особенностей некоторых клеточных линий. Такая посуда проста в использовании, т. к. выпускается в стерильном, готовом к работе виде. Стерилизация производится в процессе изготовления физическими (облучение УФ светом или гамма-лучами) или химическими (газы - окись этилена, жидкости - этиловый спирт, раствор пергидроля) способами. Пластиковая посуда производится в двух модификациях: для культивирования микроорганизмов и для культивирования клеток. Такое разделение вызвано тем, что культивируемые клетки (речь идет о монослойном культивировании) в отличие от бактериальных клеток находятся в непосредственном контакте с поверхностью сосуда, которая является для них субстратом. Клетки оседают на этой поверхности, прикрепляются и распластываются. Для улучшения адгезионных свойств поверхности из полистирола ее подвергают специальной обработке, в то время как биологическая посуда не обрабатывается.
Таким образом, одним из первых условий успешного культивирования клеток является хороший субстрат, т. е. посуда, обеспечивающая максимальную адгезию, распластывание и, следовательно, рост.