- •Актуальность применения культур клеток в различных областях биологии, медицины и сельского хозяйства
- •Роль клеточных культур в биотехнологии при производстве биологически активных веществ, белков, ферментов, аминокислот, гормонов, вакцин и др.;
- •Применение клеточных культур для диагностики и лечения наследственных заболеваний.
- •Применение клеточных культур в качестве тест-объектов при испытании новых фармакологических веществ.
- •Применение клеточных культур для сохранения генофонда исчезающих видов животных и растений.
- •Аппараты для очистки воды, используемой для приготовления питательных сред или мытья культуральной посуды. Их характеристика и возможности получения сверхчистой и общелабораторной воды.
- •7. Приборы, аппараты и реактивы для мытья и стерилизации посуды.
- •8. Приборы для дозирования, разведения и пробоотбора.
- •9. Боксовые помещения и ламинар-боксы. Их типы, обустройство и значение.
- •10. Лабораторные термостаты. Специальные требования, предъявляемые к лабораторным термостатам для культивирования клеток, и типы их конструкций.
- •12. Лабораторные ферментеры. Их назначение, типы, конструкция и области применения.
- •13. Глубинное культивирование клеточных и бактериальных культур.
- •14. Общая модель динамики роста клеточных культур.
- •15. Специфические особенности работы с ферментерами. Проблемы пенообразования и пеногашения.
- •16. Специфические особенности работы с ферментерами. Хемостаты и турбидостаты.
- •17,18. Культуральная посуда. Особые требования к свойствам поверхности и материала изделий из стекла и пластика, предназначенных для роста клеток в монослое.
- •19. Области применения стеклянной и пластиковой посуды. Основные подходы, способы и степень подготовки культуральной посуды к культивированию клеток.
- •20. Принципы составления питательных сред.
- •21. Устройства для приготовления питательных сред.
- •22. Основные требования, предъявляемые к питательным средам для клеточных культур.
- •23. Установки для стерилизующей фильтрации жидких питательных сред. Микро- и ультрафильтрация питательных сред.
- •24. Основные типы и состав питательных сред для культивирования различных типов клеток.
- •25. Основные питательные потребности клеток
- •26. Преимущества и недостатки разных типов питательных сред
- •27. Историческое развитие культивирования микроорганизмов. Работы л.Пастера, р.Коха и др. По созданию методов культивирования и изучению питательных потребностей микроорганизмов
- •28. Методы выделения чистых культур аэробных и анаэробных микроорганизмов
- •1) Механическое разобщение
- •29. Питательные среды для культивирования микроорганизмов
- •30. Динамика роста клеточных культур микроорганизмов
- •31. Подбор состава культуральных сред с учетом типов питания культивируемых микроорганизмов.
- •32. Влияние условий культивирования на жизнедеятельность микроорганизмов.
- •33. Потребность в кислороде и аэрация. Культивирование анаэробных микроорганизмов.
- •34. Динамика роста культуры микроорганизмов и характерные особенности каждой фазы.
- •35. Параметры роста: скорость роста, урожай клеток, время генерации, длительность лаг-фазы, экономический и метаболический коэффициенты и др.
- •36. Особенности культивирования бактериальных, дрожжевых и грибных клеток.
- •37. Динамическое и статическое (стационарное) культивирование.
- •38. Открытые и закрытые системы культивирования.
- •39.Поверхностное и глубинное культивирование, суспензионные культуры.
- •40.Периодический, продлённый периодический, многоциклический и непрерывный процессы культивирования клеток микроорганизмов
- •41.Методы создания и биологические свойства синхронных культур микроорганизмов.
- •42.Управляемое культивирование микроорганизмов с заданными свойствами.
- •43, 44. История создания культур клеток растений. Значение работ немецких ученых х.Фехтинга, к.Рехингера, г.Габерландта. Опыты Роббинса и Котте.
- •45. Методы создания клеточных культур растений
- •46. Получение культуры каллусных клеток.
- •47. Среды и методы выращивания каллусных клеток: поверхностный способ на агаризованной питательной среде.
- •48. Суспензионные культуры и глубинное культивирование, культивирование отдельных (одиночных) клеток.
- •49. Динамика роста популяции растительных клеток и особенности каждой фазы
- •50. Протопласты растительных клеток.
- •51. Способы выделения растительных протопластов и условия культивирования протопластов.
- •53. История и проблемы развития культивирования животных клеток. Основные культивируемые элементы.
- •54. Возможности и способы получения и особенности существования первичных культур.
- •55. Значение и возможности использования культивируемых животных клеток.
- •56. Особенности поведения и развития нормальных, трансформированных и опухолевых клеток.
- •57. Монослойные и суспензионные клеточные культуры. Типы культуральных систем для непроточных и проточных культур.
- •58. Выбор питательных сред и субстратов для культивирования животных клеток.
- •59. Состав питательных сред (среды, содержащие сыворотку, и бессывороточные питательные среды). Значение сывороточных компонентов.
- •60. Динамика развития клеточных линий и влияние физических, химических и биологических факторов.
27. Историческое развитие культивирования микроорганизмов. Работы л.Пастера, р.Коха и др. По созданию методов культивирования и изучению питательных потребностей микроорганизмов
Исследование культивирования микроорганизмов начинается с 1830 г., когда Ш. Каньяр де Латур, К. Кютцинг и Т. Шванн открыли причину брожения вина (наличие клеток дрожжей).
В дальнейшем в области культивирования клеток не было никакого прогресса вплоть до 1850-х гг., когда Л. Пастер начал свои фундаментальные исследования: изучение физиологии дрожжей и бактерий, введение асептических методов, минимальных сред и исследование пищевых потребностей микроорганизмов и роли кислорода в процессах их жизнедеятельности. Работами Л. Пастера и его ученика Манона Ролэна была установлена потребность в главных и второстепенных компонентах среды и в источниках энергии. Первая полная среда определенного состава была получена М. Ролэном в 1869 г. для культивирования грибов рода Aspergillus. Ролэн определил пищевые потребности грибов не только качественно, но и количественно.
Говоря о замечательных работах Л. Пастера и М. Ролэна, необходимо отметить, что в их распоряжении не было метода чистых культур, предложенного Р. Кохом несколько позже (в 1870-е гг.) и дающего значительные преимущества выращивания микроорганизмов. Начиная с изящных работ Коха, методы культивирования стали основной заботой микробиологов.
Потребность микроорганизмов в сложных органических веществах − факторах роста − впервые была обнаружена Вильдье в 1901 г., когда он открыл витамин В, или «факторы биос», необходимые для роста дрожжей.
В 1930-е гг. с введением метода колб на качалках началось развитие аппаратуры культивирования. Это дало возможность применять лабораторный метод для аэрации глубинных культур, особенно глубинных культур аэробных грибов, которые раньше выращивались только на поверхности твердых или жидких сред. В поверхностных культурах окружение организма гетерогенно, а в глубинных – гомогенно, что проще для изучения и контроля. Впоследствии глубинные культуры аэробных грибов сыграли значительную роль в развитии промышленного производства антибиотиков. Возрастающее технологическое значение культуры микроорганизмов значительно стимулировало интерес к этой области и привело в 40−50-е гг. к созданию ферментеров с автоматической регуляцией условий среды. С этого времени благодаря активному развитию теории непрерывного культивирования хемостатного типа открылись широкие горизонты не только теоретического развития, но и практического применения культур клеток.
28. Методы выделения чистых культур аэробных и анаэробных микроорганизмов
Существуют следующие методы:
1) Механическое разобщение
– метод серийных разведений в жидких питательных средах (Пастер): из исследуемого материала делают ряд последовательных разведений в жидкой питательной среде. Для этого каплю посевного материала вносят в пробирку со стерильной жидкой средой, из нее каплю переносят в следующую пробирку и так засевают до 8…10 пробирок. С каждым разведением количество микробных клеток, попадающих в среду, будет уменьшаться и можно получить такое разведение, в котором во всей пробирке со средой будет находиться только одна микробная клетка, из которой разовьется чистая культура микроорганизма.
– метод пластических разведений на плотных питательных средах (Кох): применяют, если в исследуемом материале содержится много бактерий. Готовят десятикратные разведения материала в пробирках, затем выливают содержимое пробирок в стерильные чашки Петри, заливают 20 мл расплавленного и остуженного до 450С МПА, перемешивают, дают агару застыть и инкубируют чашки в термостате.
– метод рассева материала по поверхности плотных питательных сред (по Дригальскому): при таком посеве материал, находящийся на петле, расходуется постепенно, и по линиям сетки, нанесённым в конце посева, вырастают изолированные колонии бактерий.
2) Физический – для выделения спорообразующих микроорганизмов материал обрабатывают t°=70-80°С, при этом вегетативные формы погибают, остаются только споры.
3)Химический – материал обрабатывается кислотой, некислотоустойчивые бактерии гибнут, а кислотоустойчивые (возбудители туберкулёза) остаются в чистой культуре.
- антибиотики: основан на избирательной чувствительности определённых видов бактерий к отдельным антибиотикам. При посеве смеси бактерий на среду с добавлением антибиотика, вырастают нечувствительные к нему бактерии: выделение микоплазм на средах с пенициллином, выделение анаэробов на средах с аминогликозидами.
- красители: красители добавляют к питательным средам для подавления роста сопутствующей флоры.
4) Метод заражения чувствительных лабораторных животных (биологический) основан на избирательной чувствительности животных к микроорганизмам различных видов. Это выражается в быстрой скорости размножения определенного вида микроорганизмов при попадании в кровь и внутренние органы животного, откуда их затем выделяют. При этом другие виды микробов погибают под действием защитных факторов организма животного. Так выделяют, например, чистую культуру пневмококков из организма белой мыши, чистую культуру палочки туляремии из организма морской свинки.
При получении чистой культуры аэробных и анаэробных бактерий есть различия.
Аэробов выращивают в обычных условиях кислородной среды при температуре 37°С в термостате. Полученный материал микроскопируют и высевают на плотную среду, при этом механически разобщают микроорганизмы (разведением). Посевы помещают в термостат на 24-48ч при температуре 37°С. Затем на чашках Петри с посевами изучают специфические признаки колоний (размеры, форму, прозрачность колоний, поверхность, характер краев, структуру…). Из колонии готовят мазок, окрашивают по Граму (грамотрицательные – красные, грамположительные – фиолетовые) и микроскопируют. Остаток колонии пересевают на скошенный агар для получения ЧК в достаточном количестве – культивируют в термостате 24-48 ч при температуре 37 °С. Изучают морфологические, тинкториальные, БХ, серологические свойства.
Анаэробов выращивают при пониженном содержании О2, облигатные – при полном его отсутствии (материал помещают внутрь жидкой или полутвердой пит среды). На дно помещают кусочки печени или фарша (для адсорбции О2). Перед посевом среду кипятят для удаления воздуха, затем быстро охлаждают, после посева заливают стерильным вазелиновым маслом. Посевы на поверхности плотных сред, разлитых в чашки Петри, культивируют в макро– или микроанаэростате.