11. Приготовление питательных сред

Питательные среды по своей сущности являются искусственной средой обитания микробов и поэтому должны соответствовать следующим требованиям:

- содержать основные питательные вещества, из которых строится микробная клетка: макроэлементы (азот,углерод,водород,кислород,фосфор,железо, калий, кальций, сера, магний), микроэлементы (кобальт, йод, марганец, молибден, цинк, медь и др.), витамины. Все элементы должны находится в легкоусвояемой для конкретного микроорганизма форме. В питательные среды добавляют аминокислоты, органические кислоты, витамины, сахара, многоатомные спирты, белки, соли различных кислот и воду;

- иметь достаточную влажность (не менее 20 % воды), т.к. поступление веществ в микробную клетку осуществляется при помощи диффузии и осмоса;

- быть изотоничными, т.е. иметь концентрацию солей соответствующую концентрации солей в микробной клетке (для большинства микроорганизмов 0,5%, для галлофилов – 3 %);

-быть нетоксичными для исследуемых микробов;

-обладать оптимальной для выращиваемого микроорганизма концентрацией водородных ионов (рН). Питательные вещества могут усваиваться микробами только при определенной реакции питательной среды, т.к. от этого показателя зависит проницаемость оболочки микробной клетки. Для большинства микроорганизмов оптимум роста наблюдается при рН 7,2-7,4;

-быть по возможности прозрачными, т.к. это облегчает изучение в них роста микробов;

-быть стерильными, чтобы была возможность размножать в них культуру только одного вида микроба.

Классификация питательных сред

Потребность в питательных веществах у различных микробов спруляция неодинакова, поэтому нет возможности создать для них универсальную питательную среду. На основании разных показателей питательные среды классифицируют следующим образом.

1.По консистенции: жидкие, плотные, полужидкие;

2.По происхождению - животного, растительного происхождения и синтетические среды постоянного состава;

3.По назначению:

-обычные(простые)-для выращивания большинства микроорганизмов;

-специальные - для культивирования микробов, не растущих или плохо растущих на обычных питательных средах;

-дифференциально-диагностические - употребляемые для определения родовых или видовых особенностей исследуемых бактериальных культур (гемолитических, сахаролитических, протеолитических, редуцирующих и других свойств);

-элективные - для выделения микробов одного рода или вида из материала, содержащего смесь разных видов микроорганизмов, на которых одни виды хорошо растут, а другие не растут;

-среды обогащения (накопительные).

Основой многих питательных сред животного происхождения является мясная вода. Ее готовят из свежего нежирного говяжьего мяса, освобожденного от костей, фасций, сухожилий. Измельченное мясо (мелкие кусочки или фарш) заливают дистиллированной водой в соотношении 1:2 (на 1 кг мяса 2 л воды). Экстрагируют 12-24 ч, кипятят 1,5-2 ч, фильтруют, добавляют дистиллированной воды до первоначального объема, разливают в бутыли, колбы, закрывают ватно- марлевыми пробками и стерилизуют в автоклаве.

Простые питательные среды

Мясо-пептонный бульон (МПБ) - жидкая питательная среда. Для его приготовления к 1 л мясной воды добавляют 1 % пептона, 0,5 % химически чистой поваренной соли и кипятят. Мясная вода слабокислой реакции, поэтому МПБ подщелачивают – добавляют небольшое количество 10-15 % раствора КОН или NaOH, кипятят 2-3 мин. МПБ фильтруют через бумажный фильтр, разливают по пробиркам, автоклавируют.

Мясопептонный агар (МПА) - плотная питательная среда. К МПБ добавляют 2 % агар-агара (органическое вещество, полученное из морских водорослей)и кипятят до его расплавления, в горячем виде устанавливают рН, кипятят 5-10 мин, фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки или колбочки, автоклавируют. После стерилизации горячие пробирки с агаром раскладывают наклонно под углом 5-6°. При застывании образуется скошенная плотная поверхность.

Мясо-пептонный полужидкий агар готовят так же, как и МПА но агар-агара добавляют меньше – 0,2 %.

Мясо-пептонный желатин (МПЖ). К МПБ добавляют 10-20 % желатина (продукт, получаемый из клейдающих тканей животных), расплавляют и в горячем виде устанавливают нужную реакцию среды, пропускают через ватно- марлевый фильтр, разливают в пробирки, стерилизуют текучим паром дробно. На рисунке 40 представлены различные формы разжижения желатина.

Молоко – натуральная естественная питательная среда. Цельное молоко обезжиривают центрифугированием, разводят водой 1:1, устанавливают рН 7,0-7,3 с помощью питьевой силы. Молоко стерилизуют дробно текучим паром 3 дня в автоклаве при 110 °С 20 мин. При изучении редуцирующих свойств микробов перед стерилизацией добавляют 2 % раствор метиленового синего из расчета 2 мл краски на 100 мл среды.

Специальные питательные среды

Анаэробы –большая группа микроорганизмов,которые растут и размножаются при отсутствии кислорода воздуха. Анаэробный тип дыхания менее продуктивный, чем аэробный, поэтому питательные среды для анаэробов должны быть богаче питательными субстратами и витаминами. Для удаления из сред кислорода в них помещают кусочки печени, головного мозга, почек. Тканевые клетки обладают редуцирующими свойствами, т.е. активно поглощают и адсорбируют на себе кислород, в результате чего в среде создаются анаэробные условия. Среды в пробирки разливают высоким столбиком в объеме 10-12 мл. Кислород воздуха диффундирует обычно на расстоянии 1-2 см от поверхности, а в глубине создаются анаэробные условия.

Мясо-пептонный печеночный бульон Китта- Тароцци - жидкая среда для культивирования анаэробов. Печень крупного рогатого скота нарезают мелкими кусочками, заливают водой 1:1, кипятят, фильтруют и печеночную воду добавляют к МПБ 2:1 (на 2 л МПБ 1 л печеночного отвара), кипятят, устанавливают рН, разливают по пробиркам высоким столбиком, в которые предварительно положены кусочки вареной печени. В пробирки поверх среды наливают 1-2 мл вазелинового масла и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. 30 мин.

Сахарно-кровяной агар Цейсслера (специальная обогащенная среда для анаэробов). Готовят 3 % МПА и добавляют 2 % глюкозы и 10-20 дефибринированной крови, подсушивают 4-6 часов в термостате и используют.

Методы создания анаэробных условий

1.Физические методы:

- основной и наиболее часто применяемый метод - выращивание культур анаэробов в специальных приборах –анаэростатах, из которых откачивается воздух с помощью механического насоса. В анаэростатах создается отрицательное давление, уровень которого контролирует манометр. Чашки с посевами на поверхности среды помещают в анаэростат вверх крышкой, герметично закрывают крышку анаэростата и откачивают воздух. Анаэростат помещают в термостат. Учет роста проводят через 1-2 дня.

-выращивание микроорганизмов в глубине питательной среды, разлитой «высоким столбиком». При таком способе культивирования среды часто подвергают дополнительной обработке: прогревают питательные среды на водяной бане для удаления растворенного кислорода; наслаивают на поверхность питательной среды вазелиновое масло, расплавленный парафин и другие компоненты, не пропускающие воздух.

2.Химические методы, основанные на поглощении свободного кислорода воздуха в результате химических реакций. Реактивы (гипосульфит натрия и гидроксид калия) смешивают, слегка увлажняют водой и в открытой чашке ставят на дно специального стеклянного сосуда с плотно закрывающейся крышкой – эксикатора непосредственно перед размещением В ней чашек с посевами.

3.Биологические методы – совместное выращивание культур аэробов и анаэробов. Применяют крайне редко. В чашку Петри наливают сахарно-кровяной агар. После застывания агара посредине чашки в питательной среде вырезают канавку шириной 1-1,5 см, которая делит питательную среду на две половинки. Одну из них засевают культурой аэробов (чудесная или кишечная палочка), другую – анаэробов. Для предупреждения поступления кисло- рода извне крышку заклеивают лейкопластырем.Чашки с посевами устанавливают в термостате вверх дном. Быстрорастущие аэробы, поглощая кислород, создают условия для роста анаэробов.

Сахарный (глюкозный) бульон (или агар) изготавливают как обычные среды, но к ним добавляют 1-2 % глюкозы и стерилизуют текучим паром или автоклавируют при 0,5 атм.

Сывороточный бульон и сывороточный мясо-пептонный агар готовят путем асептического добавления к МПБ или расплавленному и охлажденному до 45- 50° МПА 5-10 % стерильной сыворотки крови лошади (барана, кролика), затем сывороточный бульон разливают в стерильные пробирки (колбы).

Среда Петраньяни (среда для выращивания микобактерий туберкулеза)содержит цельное молоко, пептон, крахмал, поваренную соль, картофель, кури- ные яйца, желток,глицерин, малахитовая зелень.

Дифференциально-диагностические среды

Кровяной МПА применяют для выявления гемолитических свойств бактерий. Дефибринированную кровь (5-10 %) стерильно добавляют к расплавленному и остуженному МПА, легким вращением колбочки равномерно смешивают и разливают в стерильные чашки Петри.

Среды Гисса. В пептонную воду (состоящую из дистиллированной воды, 0,5% NaCl и 1 % пептона) добавляют 0,5 % углевода (сахар или многоатомный спирт) и 0,5 % индикатора Андрэдэ (0,5 г кислого фуксина, 16 мл 4 % NaOH, 100 мл дистиллированной воды). Среды с углеводами разливают в пробирки с «газовичками» (поплавками), опущенными в пробирки вверх дном. Стерилизуют среды с углеводами текучим паром дробно. Среды Гисса могут быть жидкие и полужидкие (без газовок), содержащие 0,25 % агара. При ферментации того или иного углевода микробом, растущим в данной среде, образуется кислота, под действием которой восстанавливается цвет краски индикатора. Среда приобретает красный цвет. Образовавшиеся при ферментации углевода газообразные продукты скапливаются в поплавках.

Среда Эндо. В расплавленный МПА вносят 0,5-1 % лактозы и 0,5 % насыщенного спиртового раствора основного фуксина, обесцвеченного добавлением по каплям 10 сернокислого натрия. Среду кипятят и разливают в чашки Петри. Бактерии, сбраживающие лактозу, на этой среде растут в виде красных колоний, а лактозонегативные образуют светло-розовые колонии.

Среда Левина. Содержит питательный МПА, лактозу, индикатор щелочной эозин, метиленовый синий. Цвет среды коричнево- фиолетовый (цвет гнилой вишни). Лактозоположительные бактерии образуют темно-фиолетовые или черные колонии, лактозоотрицательные–серовато- голубые прозрачные колонии.

Среда Плоскирева – основные компоненты сре ды: питательный МПА, лактоза, соли желчных кислот, кальцинированная сода, бриллиантовый зеленый, йод. Индикатор среды нейтральный красный. Цвет розово-желтый. Лактозоположительные бактерии образуют ярко розовые, брусничного цвета колонии, лактозоотрицательные – бесцветные серо- желтые колонии, среда вокруг которых желтеет.

Висмут-сульфит агар (среда Вильсон-Блера). Среда для сальмонелл и выделения анаэробов из объектов внешней среды. Непрозрачная среда молочно-мутного цвета с зеленоватым оттенком. Дифференцирующее действие этой среды зависит от способности бактерий образовывать сероводород, который в химической реакции с сульфитом висмута дает висмут черного цвета. В результате образуются колонии черного цвета. Бактерии, не образующие сероводород, вырастают в виде мелких бесцветных или зеленовато-коричневых колоний.

Применяют также среды с химическими веществами, которые изменяют окраску в результате окислительно-восстановительных (редуцирующих) процессов, обусловленных ферментами бактерий. Для этого готовят молоко с метиленовой синькой. Свежее обезжиренное коровье молоко подщелачивают двууглекислым натром до слабощелочной реакции по лакмусовой бумажке, добавляют 1 % водный раствор метиленовой синьки до голубого окрашивания. Стерилизуют текучим паром дробно.

Среды накопления (обогащения)

Среда Шустовой. К МПА добавляют 10 % 50 % водного раствора гипосульфита и 2 % раствора Люголя. Применяют для накопления бактерий паратифа.

Среда Раппопорт. К МПБ добавляют 1 % глюкозы, 10 % желчи и 1 % индикатора Андрэде. Стерилизуют текучим паром.

Синтетические среды

Применяют для изучения метаболизма бактерий и других биологических особенностей. Их составляют из химически чистых растворимых в воде веществ, в строго определенных количествах. Например, среда Сотона.

Для культивирования дрожжей и плесневых грибов используют среду Сабуро – на 100 мл воды добавляют глюкозы - 4 г, пептона - 1 г, агара - 1,8 г. Стерилизуют автоклавированием