23. Какие вещества мешают определению концентрации белка колориметрическими методами и каким образом можно от них избавиться?

Спектрофотометрический метод основан на способности ароматических аминокислот (триптофана, тирозина и фенилаланина) поглощать ультрафиолетовый свет со средним максимумом поглощения при 280 нм. Таким образом, измерив величину оптической плотности при этой длине волны и используя коэффициент экстинкции для данного белка, можно рассчитать его количество.

Коэффициент молярной экстинкции является характеристикой того, насколько сильно вещество поглощает свет на заданной длине волны. Он может быть использован для определения концентрации белка в растворе при помощи спектрофотометра.

Коэффициент экстинкции белка на длине волны 280 нм зависит исключительно от числа остатков ароматических аминокислот, в частности, триптофана, и потому может быть предсказан исходя из аминокислотной последовательности.Для определения белка методом Лоури мешают примеси мочевины, меркаптоэтанола и аминов. Для измерения концентрации апобелков необходимо предварительно перевести его в раствор, не содержащие этих примесей с помощью гель-фильтрации (обессоливания).

Для того, чтобы нивелировать влияние не поглощающих в диапазоне измерения примесей, используют кювету сравнения, в которой присутствует растворитель, но отсутствует белок. Если используются колориметрические методы, то в контрольный образец вносится растворитель без белка в таком же объеме, как и в опытные и калибровочные образцы вносятся соответствующие растворы белка. Величину поглощения в кювете сравнения вычитают из величины поглощения опытного образца. Если в измеряемом растворе присутствуют детергенты (мочевина, гуанидин), то от них избавляются путем предварительного обессоливания образцов. Некоторые коммерческие наборы для определения концентрации белка содержат дополнительные добавки для нейтрализации небольших количеств детергента.

24. Опишите принцип определения концентрации белка по Лоури.

Метод основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи. Метод характеризуется высокой чувствительностью. Ha развитие окраски влияет большое количество веществ: компоненты буферных систем (трис-буфер), восстановители (цистеин, дитиотреитол, аскорбиновая кислота), комплексоны (ЭДТА), детергенты (тритон X100 вызывает выпадение осадка), сернокислый аммоний и др. В связи с этим при построении калибровочного графика для определения белка по методу Лоури в растворитель для стандартного белка необходимо включать все компоненты, содержащиеся в анализируемых пробах. Осаждение белков из растворов, или очистка белковых растворов от низкомолекуляриых компонентов путем диализа или гель-фильтрации. Интенсивность окраски комплекса, которая пропорциональна количеству белка в исследуемой пробе, измеряется спектрофотометрически.

25. Какими способами осуществляют денатурацию белков при проведении электрофореза?

Когда требуется фракционировать белки исключительно по молекулярной массе, применяют ПААГ-электрофорез (эф в полиакриламидном геле) в денатурирующих условиях. Этот метод позволяет оценить количество полипептидов в белковой смеси, при его использовании достигается очень четкое разделение зон, но активность ферментов полностью или в значительной мере может быть утрачена из-за их денатурации. Денатурирующие условия создаются путем обработки пробы избытком додецилсульфата натрия (ДСН).

ДСН также сообщает полипептидным цепочкам вне зависимости от их аминокислотного состава сильный отрицательный заряд, что позволяет разделять молекулы только по массе.

Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле используется для оценки качества белков. Перед нанесением на гель белки подвергают диссоциации нагреванием с сильным анионным детергентом — натрия додецилсульфатом (ДСН). Денатурированные полипептиды связываются с ДСН и принимают вид стержня, несущего сильноотрицательный заряд. Величина этого заряда зависит только от величины молекулы белка. ДСН-полипептидные комплексы мигрируют в геле со скоростью, зависящей от размера полипептида. Миграция этих комплексов происходит в направлении к аноду, при этом комплексы с низкими молекулярными массами движутся быстрее, чем с большими молекулярными массами. С помощью смеси стандартных белков известной молекулярной массы определяют зависимость подвижности молекул от их молекулярной массы, а наличие единичной полосы в геле является критерием чистоты белка.