20. Какие методы используют для разрушения бактериальных клеток?

Химические:

-обработка щелочью (дешево, изменение pH, после обработки щелочью не остается практически ни одной жизнеспособной клетки);

-органическими растворителями (дешево и легко, применяют для выделения ферментов из дрожжей, но требуется дополнительные тестирования, чтобы продукт не денатурировал);

-детергентами (детергенты дороги, в большинстве случаев в их присутствии белки денатурируют, а кроме того, они могут загрязнять конечный продукт).

Биологические:

1. Лизис (гидролиз клеточных стенок)

-Грамположительных бактерий (лизоцимом яичного белка);

-Грамотрицательных бактерий (лизоцимом и этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА));

-Дрожжей (одним или несколькими ферментами: β-1,3-глюканазы, β-1,6-глюканазы, манназы и хитиназы).

2. Ферментативная обработка (с применением рекомбинантных микроорганизмов для промышленного синтеза ферментов)

Физические

-немеханическими (например, с помощью осмотического шока или быстрого многократного замораживания и оттаивания), (но обычно многие клетки остаются неповрежденными);

-механическими (высокоэффективный метод)

обработкой ультразвуком (клетки разрушаются под действием гидродинамических сил), (при малых объемах);

с помощью шаровой мельницы (при больших объемах используют), (Большинство клеток разрушается под действием сдвиговых напряжений, возникающих в результате быстрого движения шариков);

гомогенизации под давлением (концентрированную клеточную суспензию продавливают через небольшое отверстие под высоким давлением, а затем давление резко сбрасывают, происходит лизис);

соударения (клеточную суспензию большой вязкости направляют под давлением на неподвижную поверхность или навстречу потоку другой суспензии).

21. Какие существуют виды хроматографии по механизму разделения веществ? Каковы особенности каждого вида?

-Распределительная – распределение в неподвижных жидких фазах (экстракция)

-Ионообменная – на разной способности веществ к ионному обмену

-Адсорбционная – основана на различии в адсорбируемости веществ твердым сорбентом

-Эксклюзионная (молекулярно-ситовая) – на различии в размерах и формах молекул разделяемых веществ

-Аффинная - на специфических взаимодействиях, характерных для некоторых биологических и биохимических процессов (например, антитело и антиген, гормон и рецептор и др.).

-Осадочная – основанная на образовании отличающихся по растворимости осадков разделяемых веществ с сорбентом

22. Как происходит разделение веществ при ионообменной и аффинной хроматографиях?

Ионообменная хроматография позволяет разделить молекулы, основываясь на ионных взаимодействиях. Неподвижная фаза имеет заряженные функциональные группы, которые взаимодействуют с анализируемыми ионизированными молекулами противоположного заряда. Этот вариант хроматографии классифицируется на два типа — катионную и анионную ионообменную хроматографию. Суть в том, что только положительно заряженные белки проходят сквозь колонку, а остальные остаются в ней. При изменении pH среды меняются заряды, и исходя из заряда выходят разные белки в зависимости от их суммарного заряда (аминокислотного).

Аффинная хроматография — разновидность лигандной хроматографии. В основе последней лежит реакция взаимодействия разделяемых примесей с лигандом, связанным с инертным носителем. В случае аффинной хроматографии в роли примесей выступают биологически активные вещества (белки, ферменты), вступающие с лигандом (тоже, как правило, органическим) в специфическое биохимическое взаимодействие. Например: антитело-антиген, гормон-рецептор, фермент-субстрат, гуанин-цитозин и тд.. Именно высокая специфичность подобного взаимодействия обусловливает высокую эффективность аффинной хроматографии и её широкое (по сравнению с другими видами лигандной хроматографии) распространение. Суть в том, что она использует структурные особенности белков для разделения. Преимущества – высокая степень очистки, недостатки – загрязнение лигандом.