Щитовидная железа. Фундаментальные аспекты. Кубарко А.И

Рис. 5.6. Сравнительный структурно-функциональный анализ аминокислотных последовательностей ядерных рецепторов. (+) и (-) обозначает соответственно отсутствие и присутствие свойства у ресинтезированного на основе кДНК белка. HRE - гормон-чувствительный элемент ДНК. Видовая специфичность обозначена: h - человек, r - крыса, m-мышь, с- цыпленок, d -дрозофилла.

Ряд исследований показал, что рецепторы тиреоидных гормонов после их синтеза подвергаются транслокации в ядро и перманентно существует в ДНК-связанной форме (без связи с белками теплового шока) и, таким образом, не претерпевают лиганд-индуцированной трансформации. Также не обнаружено цитозольной формы рецепторов тиреоидных гормонов и ретиноевой кислоты. Клетки чувствительных к действию ретиноевой кислоты тканей содержат так называемый клеточный связывающий белок, CRABP, который может служить цитозольным переносчиком гормона.

Современное прочтение теории двухстадийной активации рецепторов стероидных гормонов заключается в дискуссионности вопроса о присутствии цитозольного рецептора и необходимости его трансформации и транслокации в ядро. Большинство исследователей разделяет мнение о валидности двухстадийной активации рецептора. Спорным остается положение о цитоплазменно-ядерном равновесии распределения рецепторов сам механизм транслокации.

5.3. Ядерные рецепторы тиреоидных гормонов

Хотя предположение о реализации эффектов тиреоидных гормонов через связывание с ядерными рецепторами впервые было выдвинуто еще в 1967 году, первые попытки продемонстрировать наличие специфических клеточных рецепторов оказались неудачными. Лишь в 1972 году в серии экспериментов, проведенных в лаборатории Oppenheimer, было убедительно доказано наличие высокоаффинных,

обладающих низкой емкостью (быстро насыщаемых) связывающих мест трийодтиронина (Т3) в ядрах клеток печени и почек. Этот результат был получен в эксперименте на интактных крысах после внутривенного введения следовых доз [131I]Т3 с последующей инъекцией прогрессивно возрастающих количеств немеченного трийодтиронина. После декапитации ткани животных были подвергнуты субклеточному фракционированию. Детальное изучение фракций клеток печени выявило специфическое связывание меченного лиганда только в ядерной фракции. Последующие исследования показали, что специфические места связывания принадлежат негистоновым белкам хроматина. Затем были установлены закономерности равновесия Т3 между ядерным и цитоплазматическим пулами и аналогичное ядрам клеток печени связывание Т3 было обнаружено в клетках мозга, почек, селезенки и гипофиза. Специфическое связывание Т3 ядерным рецептором было подтверждено не только исследованиями конкурентного замещения лиганда in vivo, но и в культуре клеток и изолированных ядрах печени in vitro, обнаружив при этом поразительное сходство.

В настоящее время установлено, что рецепторы тиреоидных гормонов представляют собой негистоновые белки, связывающие тиреоидные гормоны с высокой аффинностью (Kd = 10-10-10-11 М) и специфичностью. В общем случае, месту связывания лиганда могут быть приписаны характеристики специфического ядерного рецептора при выполнении следующих обязательных условий:

-высокое сродство и низкая емкость связывания лиганда;

-обнаружение во всех тканях, отвечающих на действие гормона;

-сходные физико-химические характеристики выделенных из различных источников рецепторов;

-биологический ответ, иницируемый связыванием лиганда, развивается в зависимости от числа занятых ядерных рецепторов;

-короткий промежуток времени между связыванием лиганда и изменением транскрипционной активности чувствительных промоторов;

-наличие корреляция между действием структурных аналогов и их связыванием с ядерными рецепторами.

Сэтой точки зрения важно обратить внимание на зависимость биологического действия тиреоидных гормонов от позиции йодирования

вфенольном кольце: наличие атома йода в положении 3' дает более

выраженный эффект, чем йодирование в обоих 3' и 5' позициях. Т4 и рТ3 по сравнению с Т3 проявляют меньшую тиромиметическую активность, а их связывание с рецептором в 1000 раз менее аффинно,

чем Т3.

Гипотеза, объясняющая генетические механизмы действия тиреоидных гормонов основывается на следующих общих положениях:

1) гормональный эффект определяется исключительно числом занятых ядерных мест связанных рецепторов и продолжительностью связывания;

Рис.5.8.Ядерныерецепторыгепатоцитовкрысы.Показанасравнительная характеристика функциональных свойств и структурная гомология различных доменов.

Сравнение рецепторов, выделенных из тканей цыпленка и человека, показало их гомологию, но не идентичность, что привело к предположению о существовании множественных форм рецепторов тиреоидных гормонов и, соответственно, кодирующих их синтез генов. У человека c-erbA локализуется в двух хромосомах - 3-ей (3р22-3р24.1) и 17-ой (7q11.2-17q21). Формы, выделенные из тканей человека, стали обозначать как β, а из тканей цыпленка - α соответственно.

Вскоре гомологичный α-форме рецептор был выделен из ядер клеток мозга и получил название c-erbАα1 или α-форма. мРНК α-формы оказалась широко распространенной как в ткани мозга, так и в других органах. В 1987-88 годах из тканей человека (почки и яички) выделена мРНК другой изоформы, c-erbА-Т-1 или c-erbАα2, которая обнаруживала различия в 3'-кодирующем конце. Первоначальные исследования показали возможность α2-формы рецептора также связывать тиреоидные гормоны, но со значительно меньшей аффинностью в сравнении с β- и α1-формами. Однако, это наблюдение не нашло подтверждения в дальнейшем (рис. 5.9).

Рис. 5.9. Сравнение гомологичных доменов различных форм рецепторов тиреоидныхгормонов.Числамиобозначенпроцентподобиякаждойформы к приведенной сверху. А - сравнение α1-изоформ, В - сравнение β- изоформ, С - сравнение α1 и β1 форм.

Вскоре в результате использования методов котрансфекции был продемонстрирован трансактивирующий эффект β1-формы рецепторов, реализуемый через чувствительный элемент гена гормона роста крысы. Эти данные подтвердили функциональную активность с- erbАβ рецепторов.

мРНК, кодирующие синтез различных форм рецепторов, были выделены из ядер гепатоцитов, нейронов мозга, миоцитов сердца и других тканей. В 1989 выделена и охарактеризована β2-форма, которая обладает способностью связывать ДНК, тиреоидные гормоны и вызывать трансактивацию генов-мишеней. Оказалось также, что мРНК β2-формы представлена, главным образом, в ткани гипофиза, а тиреоидные гормоны негативно регулируют ее содержание. Негативная регуляция аналогична таковой для α1- и α2-форм, но более выражена, что весьма поразительно в сравнении с исключительно положительной регуляцией тиреоидными гормонами содержания мРНК β1 изоформы в тех же клетках. Данные сравнительного анализа изоформ рецепторов тиреоидных гормонов суммированы на рис. 5.10:

Чувствительные к действию тиреоидных гормонов элементы.

Способность рецепторов тиреоидных гормонов регулировать экспрессию генов, по крайней мере, частично зависит от присутствия в промоторе гена-мишени специфического элемента, чувствительного к действию гормона. Этот элемент представляет собой последовательность ДНК, взаимодействие рецептора с которой оказывает положительное или отрицательное влияние на транскрипционную активность гена. Регуляторные участки чаще всего располагаются недалеко от места начала транскрипции в промоторном участке гена, но иногда обнаруживаются также в 3'-нетранслируемом, или интронном участке. Действие регуляторных участков основано на распознавании и предоставлении мест для связывания специфических трансактивирующих факторов, которые в результате стимулируют или угнетают транскрипцию определенного гена. В настоящее время описаны чувствительные к действию тиреоидных гормонов элементы промоторов следующих генов: гормона роста, тяжелой цепи миозина, α- и β-субъединиц тиротропного гормона, Са++-зависимой АТФазы саркоплазматического ретикулума, малатдегидрогеназы, основного белка миелина. В результате сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей различных элементов была установлена характерная смысловая последовательность: AGGT(C/A)A, представленная на рис. 5.11. Наиболее изученным является чувствительный элемент промотора гена гормона роста, который располагается в 5'-области и представлен тремя полуповторами, локализованными между (-190) и (-164) нуклеотидами. Присутствие всех трех участков необходимо для регулируемого ответа промотора на действие тиреоидных гормонов.

Сходные участки обнаружены в промоторе гена тяжелой цепи α- миозина. Интересно отметить тот факт, что чувствительные к действию эстрогенов элементы содержат идентичные смысловые места

(полуповторы) связывания, но различаются во вставочных последовательностях палиндромных последовательностей (рис. 5.11).

Не исключена, таким образом, возможность связывания рецепторов тиреоидных гормонов с чувствительными к действию эстрогенов элементами без последующей трансактивации. Последнее означает, что связывание ДНК является необходимым, но недостаточным условием для трансактивации сопряженных генов. Более того, подобное конкурентное взаимодействие на рецепторном уровне может ингибировать эстроген-зависимую трансактивацию. Показано также взаимодействие рецепторов тиреоидных гормонов с элементами, чувствительными к действию ретиноевой кислоты и наоборот. Интересен также обнаруженный факт взаимодействия рецептора тиреоидных гормонов с рецептором ретиноевой кислоты, которое приводит к формированию гетеродимера с отличным регуляторным потенциалом в сравнении с мономерной формой рецепторов.

Функция рецепторов тиреоидных гормонов. Позитивной регуляцией гена называется последовательность событий, сопровождающая специфическое связывание лиганд-рецепторного комплекса чувствительным элементом промотора, в результате которого возрастает транскрипционная активность гена и продукция мРНК. По обратной аналогии, результатом негативной регуляции является угнетение транскрипционной активности и снижение образования мРНК.

Среди ядерных рецепторов клеток тканей крыс доминируют α1, β1 и β2 формы рецепторов тиреоидных гормонов. Их главные эффекты заключаются в трансактивации гена гормона роста и тяжелой цепи α- миозина. Показан также эффект негативной регуляции ими активности гена α-гликопротеина человека при котрансфекции. Одним из спорных вопросов остается роль множественных рецепторов тиреоидных гормонов в клетках чувствительных тканей. Результаты ограниченного числа исследований позволяют предполагать дифференциальную регуляцию активности генов-мишеней в зависимости от тканевой специфичности и распределения рецепторов.

Исследования с использованием трансфекции c-erbAα2 рецепторов крысы в клетки культивируемых тканей человека позволили выявить возможную роль этого рецептора как негативного регулятора действия тиреоидных гормонов. Эти данные согласуются также с сообщениями о занятии продуктом альтернативного сплайсинга c-erbAα2 места связывания α1-формы без развития трансактивации. Известно также, что c-erbAα2 обладает меньшей, в сравнении с α1 и β-формами рецепторов, что может быть связано с нарушением аллостерических

эффектов С-терминального участка измененного рецептора. В основе негативной регуляции c-erbAα2, возможно, лежит формирование неактивного гетеродимерного комплекса и конкуренция за места связывания с ДНК. Важным является также и то, что v-erbA реализует свое действие по сходному пути, но с меньшей аффинностью к нуклеотидной последовательности.

Негативная регуляция активности генов, чувствительных к тиреоидным гормонам, осуществляется также свободным нативным рецептором, то есть в отсутствие лиганда. Связывание трийодтиронина в активном центре рецептора в этом случае освобождает чувствительный элемент из-под ингибирующего влияния вследствие вызванных конформационных изменений молекулы рецептора. Выраженность этих эффектов в высокой степени зависит от силы взаимодействия лиганда и рецептора, а также рецептора и элемента ДНК. Таким образом, существенным отличием ядерных рецепторов тиреоидных гормонов как лиганд-зависимых транскрипционных факторов является их относительная зависимость и внутренняя регуляторная активность.

Рис. 5.12. Тканеспецифическая активность рецепторов тиреоидных гормонов и регуляция тиреоидными гормонами содержания мРНК, кодирующих синтез ядерных рецепторов. β2-изоформа представлена, а β1-изоформа стимулируется под действием трийодтиронина только в гипофизе.

5.4Аддитивноедействие агонистов

Взаимодействие рецепторов тиреоидных гормонов и ретиноевой кислоты приводит к гетеродимеризации исходных мономеров и дивергенции регуляторных влияний, которая определяется затрагиваемым чувствительным элементом и клеточным типом. Рецепторы тиреоидных гормонов могут потенцировать действие ретиноевой кислоты через палиндромную последовательность своих чувствительных элементов, однако выступают в роли антагонистов при корегуляции транскрипционной активности промотора гена тяжелой

Рис. 5.15. Транскрипционная коактивация и корепрессия. Рецепторы стероидных гормонов, например, прогестерона, содержат репрессорный домен, который связывается с корепрессором при активации рецептора анатагонистом (RU486). В зависимости от лиганда, связанного с рецептором, трансформация рецептора может формировать коактиватор либо корепрессор, соответственно положительно или негативно регулирующих транскрипцию,

5.5. Некоторые молекулярно-генетические мишени

Гормон роста

Синтез и секреция гормона роста чрезвычайно чувствительны к действию тиреоидных гормонов. Так, у гипотиреоидных крыс содержание мРНК, транскрибируемой с этого гена, в гипофизе и сыворотке очень низкие. В культуре клеток гипофиза тиреоидные гормоны также вызывают увеличение скорости транскрипции гена гормона роста. Индукция трийодтиронином экспрессии гена гормона роста хорошо коррелирует со связыванием ядерного рецептора со специфическим чувствительным элементом промотора. Очевидно, что трийодтиронин, реализуя свое действие через ядерные рецепторы, действует не изолированно, а скорее всего как составная часть сложного комплекса взаимодействующих факторов.

Контроль транскрипционной активности гена гормона роста у человека не так ясен и однозначен. Уровень соответствующей мРНК у больных может быть в норме.

nTRE

Трийодтиронин вызывает не только активацию экспрессии генов, но и зависимое от действия тиреоидных гормонов подавление транскрипционной активности. Это было установлено по влияния тиреоидного статуса на уровень мРНК в печени крыс. Оказалось, что в 40% случаев гены печени отрицательно регулировались действием Т3. Тем самым показано, что в одной и той же ткани и даже возможно в одном и том же типе клеток тиреоидные гормоны способны регулировать клеточные процессы в противоположных направлениях.