Апоптоз: фаза экзекуции: фаза высвобождения: ключевые белки

Апоптоз: фаза экзекуции: фаза высвобождения: белки фокальной адгезии

Внутриклеточнобелок FAKприкреплен, как и три других структурных FA протеина ( Альфа-актинин,талинибелок pBo-CAS), которые привязываютактинк фокальным точкам адгезии. .Пансиллин, еще один структурный FA протеин, дефосфорилирован и диссоциируется от FA .

Апоптоз: фаза экзекуции: фаза высвобождения: актиновые регуляторы

Hsp27, который участвует в реорганизацииактина, является важным фактором в перестройке актина при апоптозеэндотелиальных клеток.Гельзолинтакже вовлечен в этой фазе, как следует из исследований с гельзолин -/- клетками, демонстрирующими значительную задержку в наступлении блеббинга, хотя в конце концов он происходит Kothahota et al, 1997.

Апоптоз: фаза экзекуции: фаза высвобождения: микротрубочки (MT)

Разборка микротрубочек (МТ)происходит на ранней стадии фазы экзекуции и может быть необходима для округления клеток . Помимо прерывания внутриклеточного транспорта, разборка МТ нарушает организацию клетки и высвобождает большое число регуляторных белков, которые в норме привязаны к МТ напримерResza et al, 1997,Mills et al, 1998a,Nagata et al, 1998.

Апоптоз: фаза экзекуции: фаза высвобождения: эффекторы

Протеазы в фазе высвобождения апоптоза

На этой фазе существенную роль играют каспазы, поскольку если каспазы заингибированы, то во многих клеточных типах морфологические изменения не начинаются (однако это может происходить преимущественно в системах, где сигнальная передача апоптозных стимулов требует наличия каспаз в верхней части цепи). Каспазы связываютFA белки, включаяFAKиp130CAS.

Однако клетки многих типов сокращаются и/или начинают блеббинг невзирая на ингибицию каспаз .

Калпаины в фазе высвобождения апоптоза

Калпаины(Calpains), которые связываютальфа-актинин,фодриниталин(структурные протеины, связывающие актин и плазменную мембрану) также задействованы в фазе высвобождения. .

Киназы в фазе высвобождения апоптоза

Сигнальные воздействияp38MAP-киназыактивируютhsp27и реорганизациюактина.

Ванойкии MEKK-1, верхний регулятор p38MAP-киназы активируетсякаспазамии в свою очередь может играть роль в активациикаспазы-7. Эта потенциально положительная цепочка обратной связи может объяснить, почему вхождение в фазу экзекуции является повидимому необратмым.p21 киназа 2 (PAK2), активируетсямалыми GTPазами PacиCdc42и про нее известно, что она реорганизует актиновый цитоскелет, она переводится в активную формукаспазами.

В неумирающих клетках другой представитель этого семейства веществ,Pak1 PAC-p21-activated kinase), вызываетразборку стресс-фибрилли ретракцию за счет фосфорилированиякороткой цепи миозиновой киназы (MLCK)и уменьшения активациимиозина Sansders et al, 1999.

Таким образом Pak1 может быть важным в разборке стресс- фибрилл и косвенно в реорганизации актина.

АПОПТОЗ: ФАЗА ЭКЗЕКУЦИИ: ФАЗА БЛЕББИНГА

Апоптоз: фаза экзекуции: фаза высвобождения: блеббинг: введение

После округления клеток, которое происходит в процессе фазывысвобождения(Release) наступает фаза блеббинга. В этой фазе на мембране как бы вздуваются многочисленные пузыри, клетка как бы кипит. В это время происходит центростремительное сокращение кортикальногоактинового кольцаза счет активациимиозина II.

В то же время мембранно-актиновые связи фокально ослабляются приводя к выталкиванию блебов в зонах, где это ослабление происходит . Обратно напавленное усилие, (возможно связанное смиозином Iилимиозином IV) ретрактирует блебы и цикл повторяется. Актин и миозин могут концентрироваться в основании блебов и тонкий слой мембранно-ассоциированых актинов окружает блебы. Блеббинг не происходит в некоторых клетках, где неткаспазы 3 Janicke et al, 1988,Zheng et al, 1998.

Похоже, что в них первая фаза (высвобождение) происходит, но они не блеббируют (Pittman, R, неопубликованное сообщение), что заставляет думать, что существует некоторый клеточный механизм проверки хода процесса между стадиями высвобождения и блеббинга.

Апоптоз: фаза экзекуции: фаза блеббинга: ключевые цитоскелетные белки

Апоптоз: фаза экзекуции: фаза блеббинга: миозины

Миозин IIили обычныймиозинповидимому обеспечивает силу для динамического мембранного блеббинга как в апоптических так и в неапоптических системах Mills et al, 1998,Torgenson and McNiven, 1998. Ингибирование миозиновой моторной активности или миозиновых активаторовMLCKилиRhoAпрекращает формирование блебов в апоптических клетках Mills et al, 1998. Понимание роли необычных миозинов основывается на том факте, что общиймиозиновый моторный ингибитор( бутадион топоксин BDM) ингибирует ретракцию блебов Mills et al, 1998bи на понимании того, какую роль необычные миозино-подобныемиозин Iимиозин IVиграют в регулировке мембранных структур вообще например см.Mitchison and Cremer, 1996.

Апоптоз: фаза экзекуции: фаза блеббинга: актин.

Разрушение актинового цитоскелета действием цитохалазина Dуменьшает мембранный блеббинг Mills et al, 1998b, свидетельствуя что полимеризация актина и/или полимеризованный актин необходимы для генерации силы.

Апоптоз: фаза экзекуции: фаза блеббинга: актин-связывающие белки

Связи, которые эти белки обеспечивают между актиновым цитоскелетом и плазматическоймембраноймогут фокально нарушаться, позволяя блебам проникать в места, где мембрана не укреплена цитоскелетом.Фордин(неэритроцитный спектрин) был зарегистрирован в блеббинге много раз, так как он легко расщепляется во многих местах каспазами и калпанами Martin et al, 1995,Cryns et al, 1996,Nath et al, 1996,Wang et al, 1998.Эрзин,моезин,радиксин- семейство актин-мембранно связывающих протеинов также дефосфолирируется и диссоциирует из мембраны во время фазы экзекуции Kondo et al, 1997. Эрзин может быть связанкаспазами Knipper-Nicolai et al, 1998.

Апоптоз: фаза экзекуции: фаза блеббинга: эффекторы

Хотя каспазы связывают цитоскелетные компоненты подобные фодринуи следовательно включены в процессы на этой стадии, многие клетки блеббируют днями, в то время как каспазы в них повидимому ингибированы Mc-Carthy et al, 1997,Mills et al, 1998Активаторы миозинаMLCK, который активирует немышечный миозин II путем фосфорилирования регуляторной короткой цепи, необходимы для инициации и развития блеббинга Мills at all, 1998b,Torgensen and McNiven, 1998.

Было показано, чтоRhoAтоже важен для блеббинга Mills at al, 1998bвозможно за счет активизацииRho киназы, которая фосфорилирует и ингибируетфосфатазу миозина Noda et al, 1995,Kimura et al, 1996.

Апоптоз: фаза экзекуции: фаза блеббинга: ATP

Для блеббинга необходимо большое количествоATP(для поддержания сократимости миозина) так что генерация энергии в клетках не затрагивается Nicotera and Leist, 1997,Tsujimoto 1997.

АПОПТОЗ: ФАЗА ЭКЗЕКУЦИИ: ФАЗА КОНДЕНСАЦИИ

Апоптоз: фаза экзекуции: фаза конденсации: введение

Все клетки в конце концов заканчивают блеббинг. При нормальных условиях это обычно происходит с удивительной регулярностью примерно через час. Прекращение блеббинга сопровождается фрагментацией клетки в маленькиеапоптические частицы (тела)или конденсацией в маленькую сферу, причем актин и микротрубочки в значительной степени разобраны или деградированы Millset al, 1998a.

Стадия конденсации может просто представлять собой конечный результат блеббинга, когда сокращение оказывается достаточно сильным чтобы сжать апоптические тела. Однако ингибициякаспазможет остановить процесс формирования апоптического тела без прекращения блеббинга Mc Carthy et al, 1997,Hirate et al, 1998. Следовательно, формирование апоптического тела хотя и является прямым продолжением блеббинга, должно представлять собой отдельную стадию фазы экзекуции, немедленно следующую за блеббингом. Может существовать некий внутренний механизм контроля хода процесса между блеббингом и конденсацией или может быть клетка может конденсироваться только после того как цитоскелет был разобран/реорганизован, что позволит перейти к растворению цитоплазмы.

Апоптоз: фаза экзекуции: фаза конденсации: ключевые белки

Очень немногое известно относительно спецификации регуляторных аспектов этой финальной стадии апоптоза; однакоF-актинповидимому необходим для формирования апоптического тела Cotter et al, 1992.

Апоптоз: фаза экзекуции: фаза конденсации: эффекторы

Апоптоз: фаза экзекуции: фаза конденсации: протеазы

Каспазынаверное играют важную роль, поскольку ингибиция каспаз ведет или к морфологическим изменениям в ходе апоптоза или к задержке клеток встадии блеббинга, когда они не способны к конденсации Mc Carthy et al, 1997,Hirata et al, 1998,Huot et al, 1998,Mills et al, 1998b. Возможно роль каспаз в процессе сокращения клеток состоит, в ограничении блеббинга и индукции конденсации. Это может случиться если каспазы приводят к медленной деградации белков, нужных для блеббинга (например актина).

Другие протеазы могут также быть важными (например сериновые протеазы и протеасомальные протеазы).

Апоптоз: фаза экзекуции: фаза конденсации: PAK киназы

Pak1 киназа, активированная р21 (PAC-p21-activated kinase)повидимому важна для формирования апоптозного тела Rudell and Bokoch, 1997.

Апоптоз: фаза экзекуции: фаза конденсации: трансглютаминаза

В некоторых клетках активация протеин кросс-связывающего энзима, трансглютаминазы, была зафиксирована в процессе цитоплазматической упаковки в фазе конденсации Fesus, 1993.

Апоптоз: роль внеядерной фазы экзекуции

Апоптоз является способом удаления клеток без повреждения соседних клеток, без распространения патогенной ДНК, без возбуждения иммунной реакции. Именно в течении фазы экзекуции выполняются эти эволюционные директивы. Однако пока еще точно не известно, какие события в фазе экзекуции коррелируют с эволюционно развившимися функциями апоптоза. Например, хотя блеббинг является почти универсальным свойством, не ясно, почему клетки блеббируют. Может быть, цитоплазматические блебы являются средствами механоструктурной коммуникации соседним клеткам сигналов начать процесс фагоцитоза или может быть мембранный блеббинг в погибающих клетках нужен для расходования АТФ, чтобы смешать структурные элементы в процессе упаковки клетки или как этап необходимый для грядущего формирования апоптозного тела. В любом случае стадии высвобождения, сокращения и конденсации результируют в образовании компактных клеток или клеточных фрагментов для облегчения фагоцитозной очистки.

Для клеток, у которых существуют сильные межклеточные контакты, (таких, как эпителиальные или эндотелиальные клетки) механизм цитоплазматической фазы экзекуции может быть очень важным еще и по другой причине. Сокращение апоптирующей клетки может быть неким альтруистическим способом сохранения незатронутым всего монослоя, так как погибающая клетка затрачивает свою энергию позволяя соседним клеткам закрыть потенциальную брешь которая была бы образована на месте погибающей клетки . В эпителиальных монослоях фаза экзекуции клетки приводит к продвижению соседних клеток в сторону погибающей клетки Nagi et al, 1996,Sober et al, 1996. Стресс-фибриллы формируются в соседях, как если бы они были вытягиваемы а не сами двигались. Погибающая клетка похоже генерирует силу при помощи того же механизма который лежит в основе блеббинга ( актин-миозиновое сокращение); Поэтому ингибиция блеббинга и/или конденсационной фазы должно приводить к уменьшениюбарьерной функции эпителия.

C точки зрения организма, наиболее важным аспектом апоптоза является то, что гибель (клетки) происходит без выделения потенциально патогенных или опасных макромолекул и без заражения или повреждения соседних клеток. Главная задача фазы экзекуции состоит в обеспечении гарантий, что погибающая клетка упаковывается, чтобы исключить эти потенциально опустошительные последствия.

АПОПТОЗ: ПУТИ РЕАЛИЗАЦИИ

Существует несколько путей реализации программы апоптоза

АПОПТОЗ, ОПОСРЕДОВАННЫЙ РЕЦЕПТОРАМИ

Апоптоз рецептор-опосредованный: введение

Важное место занимает путь, опосредованный физиологическими индукторами, действие которых реализуется через клеточные рецепторы, предназначенные для включения апоптоза.

Этот путьпередачи сигнала апоптозасхематически можно изобразить следующим образом: индукторы - рецепторы - адаптеры - каспазы первого эшелона - регуляторы - каспазы второго эшелона. см.Апоптоз, опосредованный Fas рецептором

РЕЦЕПТОРЫ СМЕРТИ (АПОПТОЗА): ПЕРЕДАЧА И МОДУЛЯЦИЯ СИГНАЛОВ

РЕЦЕПТОРЫ СМЕРТИ (АПОПТОЗА)

Рецепторы смерти: общие сведения

Рецепторы смерти имеют прямую связь с механизмом апоптоза. Сигналы выживания от окружения клетки и от внутренних сенсоров контролирующих целостность клетки нормально поддерживают механизм апоптоза в состоянии готовности. В случае, если клетка теряет контакт с окружением или в ней поисходит невосстановимое внутреннее повреждение, клетка входит в апоптоз. Клетки, которые одновременно получают конфликтующие сигналы о продолжении или прекращении цикла деления также переходят в апоптоз Evan ea 1998.

У млекопитающих выработался еще и другой механизм, который позволяет активно "приказать" отдельной клетке саморазрушится. Этот тип " инструктивного" апоптозаособенно важен в иммунной системе Boise ea 1996. Рецепторы смерти - поверхностные рецепторы клетки, которые передают апоптические сигналы инициируемые специфическими " лигандами смерти" - играют главную роль в "инструктивном" апоптозе. Эти рецепторы могут активировать стимулирующие смертькаспазыза времяпорядка секундс момента связывания лигандов, вызывая апоптическое разрушение клетки в течение часов.

Рецепторы смерти принадлежат ксуперсемейству фактора некроза опухолей (TNF), и все они имеют сходные внеклеточные домены богатые цистеином Smith ea 1995. Рецепторы смерти содержат вдобавок гомологичную цитоплазматическую последовательность, называемуюдомен смерти Tartaglia ea 1993,Nagata ea 1997.

Наиболее изученными рецепторами смерти являются

CD95 (Fas, Apo1)

TNFR1 (p55, CD120a) Smith ea 1995 , Nagata ea 1997 .

CAR1 Brojatsch ea 1996 ,

D3 (Apo3, WSL-1, TRAMP, LARD) Chinnaiyan ea 1997 ,

DR4 Pan ea 1997

DR5 ( APO2 , TRALL-R2 , TRICK , KILLER ) Pan ea 1997 , Sheridan ea 1997 , Walczak ea 1997 , Screaton ea 1977 , McFarlane ea 1997 , Schneider ea 1997 .

Рецептор p75ростового фактора ( NGF) также содержит домен смерти Liepinsh ea 1997.

CD95 (Fas/APO-1) рецептор смерти

Карта белка CD95

CD95, 45 кДатрансмембранный белок I типа, был независимо обнаружен двумя группами исследователей как рецептор, передающий цитотоксический сигнал при связывании со специфическими антителами ( Traut B.C. et al., 1989,Yonehara S. et al., 1989,Itoh N. et al., 1991,Oehm A. et al., 1992).

CD95 экспрессируется в самых разнообразных клетках и тканях. Недавно был описан вариант CD95, кодирующий растворимый белок, не имеющийтрансмембранного доменав результате альтернативного сплайсинга ( Cheng J. et al., 1994), однако его физиологическая роль пока неясна.

CD95 иTNF-R1имеют гомологичную последовательность во внутриклеточной части молекул. Этот"домен смерти"абсолютно необходим для трансдукции цитотоксического сигнала ( Tartaglia L.A. et al., 1993,Itoh N., Nagata S., 1993). Цитоплазматический С-конец содержит также"домен спасения", удаление которого усиливает цитотоксическую активность рецептора ( Itoh N., Nagata S., 1993).

CD95иCD95Lиграют важную роль в основном в трех случаях физиологии апоптоза. Nagata ea 1997:

- переферийное удаление активированных взрослых T- клеток в конце иммунного ответа,

- убивания целей, таких какзараженные вирусом клеткиилираковые клеткипри помощи цитотоксигенных Т-клеток иNK- клеток,

- убивание воспаленных клеток в "иммунноважных" структурах, таких как глаз.

Данные о биологической роли СD95 поступают от изучения определенных линий мышиных клеток и от больных людей, у которых ген, ответственный за выработку СD95 дефективен Nagata ea 1997. Такие мутации могут привести к накоплениюперефирийных лимфоидных клетоки кфатальному автоиммунному синдрому, характеризующемуся массивным увеличениемлимфотических узлов.

СD95 и СD95L также причастны к патологическому подавлению иммунной реакции, именно, кудалению специфически воэдействующих на опухоль иммунных клетокв некоторых опухолях, которые интенсивно выделяют CD95L Hahne ea 1996.

Как и другие членысемейства TNF, CD95L является гомотримерной молекулой.Кристаллическая структура лимфотоксина альфа в комплексе с TNFR1заставляет полагать, по аналогии, что каждый CD95L тример связывает три молекулы CD95 Smith ea 1995,Nagata ea 1997. Поскольку смертельные домены имеют склонность ассоциироваться друг с другом, присоединение лиганда к CD95 приводит к кластеризации рецепторных доменов смерти Это подтверждается структурным анализом методом ядерномагнитного резонанса и генетическими исследованиями Huang ea 1996. Адаптерный белокFADD (Mort1)(Fas-associated death domain) Chinnaiyan ea 1995затем связывается через собственный смертельный домен с кластеризованными рецепторными доменами смерти. FADD также содержит " домен смертельного эффектора", который привязывается к аналогичному домену, тандемно повторенному вкаспазе-8 Boldin ea 1996.

При присоединении к FADD олигомеризация каспазы-8 приводит к ее активации через посредство саморазрезания Muzio ea 1998. После этого каспаза-8 последовательно активирует эффекторные каспазы, такие каккаспаза-9- функциональный гомолог CED-3 у млекопитающих - подталкивая клетки к апоптозу.

Волчаночный нефритразвивается у мышей с дефектом выработкиCD95.

Ген Fas (CD95)-рецептора (АРO1)

FADD (Mort1) и индукция апоптоза через CD95 белок

Изучение намышах с выключенным геном FADD Yeh ea 1998и с трансгенными мышами с экспрессией доминантного негативного мутанта FADD ( FADD-DN) в T-клетках Newton ea 1998установили, что FADD существеннен для индукции апоптоза за счетCD95. Удивительно, что мышиные клетки демонстрируют уменьшенную пролиферацию взрослых T-клеток в ответ на антигенную стимуляцию, более того, удаление FADD вызывает летальность эмбрионов Yeh ea 1998,Newton ea 1998. Эти результаты не противоречат тому, что FADD имеет и другие важные сигнальные функции, кроме присоединения (связывания) CD95 ккаспазе-8.

Семейство вируcных белков называемыхVFLIPи связанных клеточных белков называемыхсFLIP( Casper,I-FLICE,FLAME,CASH) Thome ea 1997содержатдомен эффектора смерти, который похож на соответствующий сегмент вFADDикаспазе-8. Роль FLIP является противоречивой, так как сверхэкспрессия FLIP или ингибирует, или активирует апоптоз Thome ea 1997.

Некоторые другие цитоплазматические белки, кроме FADD могут связываться сCD95 Nagata ea 1997, включаяDaxx белок, который распознает смертельный домен CD95 Yang ea 1997. Daxx может активировать и не зависящий от FADD путь передачи сигнала о смерти, который включает активируемую в стрессовых условиях c-Jun NH2-терминальную киназу ( JNK). Поскольку несколько типов клеток с дефицитом FADD демонстрируют полную устойчивость относительно CD95 индуцированного апоптоза Yeh ea 1998, оказывается, что по крайней мере для некоторых типов клеток Daxx не использует CD95 при апоптозе.

TNFR1 (p55, CD120a): передача сигнала белок

Gene: 12p13/TNFR1 tumor necrosis factor receptor 1 (55 kD); cachectin receptor 1 (lymphotoxin receptor 1)

TNFвырабатывается преимущественно активированными макрофагами и T- клетками в ответ на инфекцию Tartaglia ea 1992. ИспользуяTNFR1, TNF активирует факторы транскрипцииNF-kBиAP-1соответствующих иммуномодуляторных и антивоспалительных генов Tartaglia ea 1992.

В клетках некоторых типов TNF также индуцирует апоптоз при посредстве TNFR1. Однако в противоположность случаю с CD95L, TNF редко запускает апоптоз, если только синтез белка не блокирован, что наводит на мысль о том, что существуют какие-то специальные клеточные факторы, которые могут подавлять апоптические стимулы, генерируемые TNF. Экспрессия этих подавляющих белков возможно контролируется черезNF-kBиJNK/ AP-1, поскольку ингибиция любого из этих путей увеличивает чувствительность клетки к индукции апоптоза осуществляемой под действием TNF Beg ea 1998. TNF настраивает TNFR1 при связывании Smith ea 1995, индуцируя ассоциацию рецепторных доменов смерти. Вслед за этим, адаптер, называемыйTRADD(TNFR-associatrd death domain) Hsu ea 1995связывается при посредстве своего собственного домена смерти с кластерированными доменами смерти рецепторов. TRADD работает как единый адаптер который привязывает несколько сигнальных молекул к активированному рецептору. Связанный с TNFR factor 2 ( TRAF2) Rothe ea 1995,Hsu ea 1996и взаимодействующий с рецепторомбелок RIP(receptor-interacting protein) Hsu ea 1996стимулируют пути, ведущие к активацииNF-kBиJNK/AP-1, в то время как FADD приводит к активации апоптоза Hsu ea 1996,Chinnaiyan ea 1996.

Из этих компонент только RIP обладает энзиматической активностью, именно активностью серин- треонин киназы, однако роль активности RIP в активации NF- kB или JNK/AP-1 все еще нужно установить. TRAF-2 и RIP активируютNF-kB индуцирующую киназу (NIK), которая в свою очередь активируетингибитор kB (I-kB)киназного комплексаIKK Malinln ea 1997.

IKK фосфорилирует I-kB, приводя к разрушению I-kB и позволяя NF-kBтранслоцироваться к ядрудля активации транскрипции.

Путь от TRAF2 и RIP к JNKвключает каскад процессов, в который входит митоген-активированный белок ( MAP), киназыMEKK1 (MAP/Erk киназы, киназы-1),JNKK (JNK-киназы)иJNK Liu ea 1997.

MEKK1 играет ту же роль что и NIK, и он задействован в цепи передачи сигнала, потому что киназо-неактивный мутант MEKK1 блокирует активацию JNK при действии TNF, однако MEKK1 не связывается с TRAF2 Song ea 1997, что заставляет думать что другая TRAF2 связывающая киназа действует вверху по цепочке или вместо MEKK1. Мышиные клетки с удаленным геном TRAF2 или клетки от трансгенных мышей с экспрессией доминантно негативных мутантов TRAF2 демонстрируют только весьма слабую реакцию по NF-kB в ответ на TNF Yeh ea 1997. Таким образом, TRAF2 возможно и не важен для активации NF-kB за счет TNF, и наоборот, возможно существует другой член семейства TRAF, который связывается к TRADD и NIK и замещает TRAF2. В дефицитных по TRAF2 клетках не происходит активации JNK в ответ на TNF, что подчеркивает важную роль TRAF2 в этом воздействии.

Картина, следующая из реакций RIP дефицитных клеток имеет противоположный характер. NF-kB активация в ответ на TNF отсутствует, тогда как активация JNK остается ненарушенной Kelliher ea 1998. Следовательно, RIP требуется для связывания TNFR1 к NF-kB, но может быть он не важен для связывания TNFR1 с JNK. Мыши с генно-удаленными как TRAF-2 так и RIP обладают патологиями, которые не могут быть приписаны к передаче TNF сигналов, что заставляет думать что каждый из этих белков имеет еще и добавочные функции.

TRAF2 также связывается сTAP1и сc-TAP2(cellular inhibitor of apoptosis-1, 2) Shu ea 1996, которые принадлежат к семейству белков животных и вирусов с анти- апоптической активностью.

FADD связывает TNRF1-TRADD комплекс сактивацией каспазы-8, таким образом инициируяапоптоз Hsu ea 1996,Chinnaiyan ea 1996. Клетки мышей с генетически удаленным FADD устойчивы к индуцированному TNF апоптозу, что демонстрирует определяющую роль FADD в этой реакции Yeh ea 1998. Кроме FADD, TNRF1 может привлекать адаптер называемыйRAIDD (CRADD) Duan ea 1997. RAIDD связывается через домен смерти с доменом смерти RIP и через CARD элемент к аналогиченой последовательности в эффекторе смертикаспазы-2, таким образом инициируяапоптоз.

DR3 (Apo3, WSL-1, TRAMP, LARD) рецептор: передача сигнала

DR3демонстрирует очень похожую организацию структуры цепочки передачи сигналов как ипередача сигнала через TNRF1 Chinnaiyan ea 1997. При гиперэкспрессии DR3 эапускает серию событий, подобных TNRF1, а именно,NF-kB активациюиапоптоз. Подобно TNRF1, DR3 активирует NF-kB черезTRADD,TRAF2иRIPи апоптоз черезTRADD,FADDикаспазу-8. DR3 связывается сApo3L, который очень похож наTNF Marsters ea 1998.

Apo3Lактивирует NF-kB через TRADD, TRAF2, RIP иNIKи запускает апоптоз через TRADD и FADD, аналогично тому, как это происходит для DR3. Таким образом, в отношении к регулирования NF-kB и апоптоза Apo3L близко напоминаетTNF.

Однако есть и заметные различия в экспрессии этих лигандов и рецепторов. Экспрессия TNF происходит главным образом вактивированных макрофагахилимфоцитах Tartaglia ea 1992, тогда как Apo3L мРНК экспрессируется существенно во многих тканях Chicheportiche ea 1997,Marsters ea 1998. И наоборот, TNRF1 экспрессируется повсеместно Tartaglia ea 1992, тогда как DR3 транскрипты присутствуют главным образом вселезенке,тимусеипериферийной кровии индуцируется приактивации в T-клеток Chinnaiyan ea 1997. Следовательно, несмотря на перекрытие (похожесть) сигнальных механизмов, Apo3L-DR3 и TNF-TNFR1 взаимодействия, возможно, имеют различия в биологических функциях.

DR3 и DR5 рецепторы: модуляция передачи сигнала Apo2L ложными рецептор

Члены семейства TNF , которые проявляют наибольшую схожесть с CD95L были выявлены независимыми исследователями двух групп, которые назвали ихTRAIL (Apo2L), это лиганд DR3 и DR5 Wiley ea 1995. К удивлению, эктопическая экспрессияFADD-DNв количествах, достаточных для блокирования смерти клеток, индуцированной CD95 не блокирует апоптоз, индуцированный Apo2L, что свидетельствует о наличии независимых от FADD сигнальных путей свяэывающих Apo2L с каспазами Marsters ea 1996.

Сверхэкспрессия DR4 Pan ea 1997илиDR5 Pan ea 1997,Sheridan ea 1997,Walczak ea 1997,Screaton ea 1977,McFarlane ea 1997,Schneider ea 1997, которые связываются с Apo2L, запускает апоптоз. Однако существуют конфликтующие сообщения по поводу действия трансфекции FADD-DN на это воздействие. Некоторые исследователи не замечали никакого эффекта Pan ea 1997,Pan ea 1997,Sheridan ea 1997, в то время как другие наблюдали ингибирование Walczak ea 1997,Schneider ea 1997. Это разночтение распространяется также на оценки способности DR4 и DR5 связываться с известными адаптерами: некоторые эксперименты не видят такого взаимодействия Pan ea 1997,Pan ea 1997, тогда как другие показывают связь с TRADD, FADD, TRAF2 и RIP Walczak ea 1997,Schneider ea 1997.

Поскольку взаимодействия наблюдались в специальных экспериментах с котрансфекцией, возможно, что ненормально большое количество рецепторов и адаптеров приводит к беспорядочной гомофильной ассоциации между доменами не взаимодействующими физиологически. Клетки мышей с генетически удаленным FADD которые устойчивы к индукции апоптоза при посредстве CD95, TNFR1 и DR3 демонстрируют полную чувствительность к DR4, что и подтверждает существование независимых от FADD путей, связывающих Apo2L с каспазами Yeh ea 1998.

Подобно Apo2L mRNA, DR4иDR5транскрипты экспрессируются в нескольких тканях, что заставляет думать что могут существовать механизмы которые предохраняют клетки от вхождения в апоптоз под действиемApo2L. Один тип такого предохранения основывается на существовании уникальной серии "обманных"DcR рецепторов, которые конкурируют с DR4 и DR5 в связывании Apo2L Golstein ea 1997.

DcR рецепторы DсR1 и DсR2

DcR1 (TRID, TRAIL-R3, LIT) рецептор белок

DcR1 рецептор Pan ea 1997,Sheridan ea 1997,McFarlane ea 1997,Schneider ea 1997,Degli-Esposti ea 1997,Mongkolsapaya ea 1998представляет собой клеточный поверхностный белок сгликосил-фосфатидилиноситольным якорем (GPI), который напоминает DR4 и DR5, но у которого отсутствует цитоплазматический хвост. DcR1 связывается сApo2Lи его трансфекция в Apo2L чувствительные клетки существенно снижает реакцию на лиганд Pan ea 1997,Sheridan ea 1997,Mongkolsapaya ea 1998. Обработка клеток, несущихDcR1, фосфолипазой, которая отщепляет GPI группу, приводит к заметному увеличению чувствительности к апоптозу, индуцированномуApo2L Sheridan ea 1997. Таким образом, DcR1 повидимому действует как "пустышка" (обманка), которая предотвращает связывание Apo2L с рецепторами смерти.

DcR2 (TRAIL-R4 или TRUNDD) рецептор белок

DcR2 рецептор Marsters ea 1997,Degti-Esposti ea 1997,Pan ea 1998является другим рецептором, напоминающимDR4иDR5, но он обладает существенно укороченным цитоплазматическим доменом смерти. Четыре из шести аминокислотных групп, которые критичны для апоптоза и активации NF-kB при посредствеTNFR1 Tartaglia ea 1993отсутствуют в DcR2. Трансфекция DcR2 ингибирует индукцию апоптоза Apo2L Marsters ea 1997,Degti-Esposti ea 1997,Pan ea 1998. Удаление цитоплазматической секции Dcr2* не аннулирует ингибиторной активности Marsters ea 1997, указывая что этот рецептор работает как обманка, конкурирующая сDR4иDR5в отношении связыванияApo2L.

Сверхэкспрессия DcR2 приводила к активации NF-kB в одном исследовании Degti-Esposti ea 1997, но этого не наблюдалось в другом Mongkolsapaya ea 1998и вопрос о том, стимулирует ли сам лиганд NF-kB через (при посредстве) DcR2 еще необходимо исследовать. Гены, кодирующие DR4, DR5, DcR1 и DcR2 все находятся на человеческой хромосоме 8p21-22, так что скорее всего они происходят от общего прародительского гена Marsters ea 1997,Degti-Esposti ea 1997. Сообщают, чтосекретируемый TNFRгомолог называемыйостеопротегерин, который располагается на хромосоме 8q23-24 и не сцеплен сильно с последними четырьмя рецепторами, связывается с Apo2L и ингибирует функцию Apo2L Emery ea 1998. Однако такое наблюдение было зафиксировано в одном исследовании, но не в другом Simonet ea 1997.

Fas/APO-1 (CD95): Роль в апоптозе

Карта белка Fas

Рецептор Fas, взаимодействуя с соответствующим лигандом (лигандомFasL), трансмембранным белком Т-киллера, активируется и запускает программу смерти клетки, инфицированной вирусом. Тем же путем при взаимодействии с лигандом FasL на поверхности Тн-1 -лимфоцитов или с антителом к Fas-рецептору погибают ставшие ненужными выздоровевшему организму В-лимфоциты, продуценты антител, несущие Fas-рецептор. FasL -лиганд, относящийся к многочисленному семейству лигандов фактора некроза опухолейTNF лигандыFas - членсемейства рецепторов TNF.

Среди различных моделей клеточной гибели апоптоз, индуцируемый черезCD95ирецептор TNF, исследуется наиболее интенсивно в связи с его большой биологической значимостью(см. обзоры Cory S., 1994 , Smith C.A. et al., 1994 , Schultze-Osthoff K., 1994 ).

Апоптоз, индуцированный черезCD95, участвует вклональной селекции Т и В клеток. У мышей с мутациями в CD95,lpr( lymphoproliferation) мыши, или его лиганде,gld( generalized lymphoproliferative disease) мыши, развиваетсялимфоаденопатияиаутоиммунная патология, аналогичнаясистемной красной волчанке( Cohen P.L., Eisenberg R.A., 1992,Singer G.G. et al., 1994,Watanabe-Fukunaga R. et al., 1992,Takahashi T. et al., 1994).

Один из основных механизмовТ-клеточной цитотоксичностиопосредован через CD95 ( Stalder T. et al., 1994,Kagi D. et al., 1994,Lowin B. et al., 1994). Недавно полученные результаты свидетельствуют о том, что падение числаCD4+ Т-клетокприСПИДетакже связано с CD95-опосредованным апоптозом ( Westerndorp M.O. et al., 1995).

Рецептор Fas, взаимодействуя с соответствующим лигандом (лигандомFasL), трансмембранным белком Т-киллера, активируется и запускает программу смерти клетки, инфицированной вирусом. Тем же путем при взаимодействии с лигандом FasL на поверхности Тн-1 -лимфоцитов или с антителом к Fas-рецептору погибают ставшие ненужными выздоровевшему организму В-лимфоциты, продуценты антител, несущие Fas-рецептор. FasL -лиганд, относящийся к многочисленному семейству лигандов фактора некроза опухолейTNF лигандыFas - членсемейства рецепторов TNF.

Апоптоз Fas-зависимый Т лимфоцитов

Лиганды рецепторов смерти

Лиганды, которые активируют эти рецепторы, за исключениемNGF, это структурно одинаковые молекулы, которые принадлежат ксуперсемейству генов TNF Smith ea 1995.

Лиганд CD95 (CD95L)связывается кCD95,TNF,

лимфотоксин альфасвязывается сTNFR1,

лиганд Apo3L (TWEAK) Marsters ea 1998,Wiley ea 1995связывается сDR3

лиганд Apo2L (L) Wiley ea 1995 , Marsters ea 1996 связывается к DR4 Pan ea 1997 и DR5 Pan ea 1997 , Sheridan ea 1997 , Walczak ea 1997 , Screaton ea 1977 , McFarlane ea 1997 , Schneider ea 1997 .

Лиганд для CAR1неизвестен.

Рецепторы смерти для индукции апоптоза в опухолях

Идея воздействия на специфическиерецепторы смертидля вызывания апоптоза в раковых опухолях является привлекательной, потому что эти рецепторы смерти непосредственно связаны с механизмом действия каспаз. Более того, в противоположность многим химиотерапевтическим средствам или радиационной терапии,рецепторы смерти инициируют апоптоз независимо от p53, подавляющего опухоли, который дезактивируется за счет мутаций в более чем половине человеческих раковых опухолей. Несмотря на эти преимущества, клиническое использование какTNFтак иCD95Lбыло затруднено токсическими побочными эффектами. Систематическое применение определенных доз TNF вызывает очень сильную реакцию воспалительного синдрома, напоминающуюсептический шок. Считается что это происходит главным образом за счет индукции провоспалительных генов в макрофагах и эндотелиальных клетках через активациюNF-kB. Инъекция антител к CD95 в пораженных раком мышах может быть летальной, очевидно ввиду индукции апоптоза вгепатоцитах, которые обильно экспрессируютCD95 Nagata ea 1997. Несколько различий между Apo2L и TNF или CD95L заставляют полагать, что Apo2L может являться более безопасным агентом. Во первых, хотяDR4иDR5могутактивировать NF-kBпри сверхэкспрессии Sheridan ea 1997,Schneider ea 1997, Apo2L сам по себе только слабо индуцирует эту реакцию, и активация требует доз сильно превышающих дозы, при которых TNF активирует сильную реакцию NK-kB Sheridan ea 1997. Во-вторых, многие ткани стандартно экспрессируютApo2LmRNA. В третьих, DR4 и DR5 экспрессируются в нормальных тканях и во многих типах раковых клеток, тогда какDcR1иDcR2экспрессируются часто в нормальных тканях но редко в раковых клетках. Эта различная экспрессия рецепторов смерти и ложных рецепторов может позволить Apo2L индуцировать апоптоз в опухолях, сохраняя нормальные клетки.

МИТОХОНДРИИ И АПОПТОЗ

Митохондрии и клеточная смерть: введение

Множество ключевых явлений в апоптозе фокусируется на митохондриях, включая высвобождение активаторов каспазы (таких, какцитохром с), изменений в транспорте электронов, потеря митохондриального трансмембранного потенциала, влияние на уменьшение окислительных процессов в клетке и участие про- и антиапоптического семействабелков Bcl-2. Различные сигналы, которые сходятся на митохондриях, чтобы запустить или ингибировать эти события и их последующие стадии выявляют несколько главных путей организации физиологической смерти клеток

Митохондрии: происхождение и апоптоз

Около 2 миллиардов лет назад клетки, которым повезло стать наследниками всех эукариот вступили в союз с предшественниками современных пурпурных бактерий. Этот союз обещал многочисленные выгоды обоим партнерам: он позволил им эксплоатировать энергетические возможности, открывающиеся в нарождавшейся кислородной атмосфере, которая была токсичной для большинства других форм жизни. Результатом была протоэукариотическая клетка, и ее новой эндосимбиотической бактерии предстояло стать митохондрией Margulis ea 1996. Этот союз был возможно ненадежным и катастрофические конфликты в отборе между двумя геномами несомненно произошли Btackstone ea 1995. Как только новый симбиотический организм вошел в аэробный мир, жизнь и смерть стала контролироваться протомитохондрией, которая поставляла не только необходимые антиоксиданты, но также была и источником реактивных кислород-содержащих веществ ( Ros), появившихся как побочный подуктоксислительного фосфорилирования. Условия, которые благоприятствовали митохондрии в клетке-хозяине должны привести к смерти клетки и высвобождению свободно существующего эндосимбионата. Следовательно, симбиоз был вначале нестабильным, пока существенные гены для митохондриального метаболизма и биогенезиса не были перенесены в ядерный геном, что привело к упорядоченному симбиозу. Некоторые исследователи предположили, что эндосимбиотические истоки митохондрии и эволюция аэробного метаболизма в эукариотах сформировали базис для эволюции процедуры активной смерти, которая проявляется преимущественно как апоптоз в метазоанах Frade ea 1997,Kroemer ea 1997. Хотя апоптоз независим от оксислительного фосфорилирования, не требуя даже участия митохондриальной ДНК Jacobson ea 1993, главенствующая роль митохондрий как ведущих элементов организации апоптоза была твердо установлена для многих систем.

Митохондрии и апоптоз, незавмсимый от каспаз

Когда умирающая клетка является действительно мертвой и когда она необратимо приговорена к смерти? В последние годы мы пришли к пониманию, что эффекторы апоптоза представлены семейством внутриклеточных цистеиновых протеаз, известных как каспазы.

Ингибиция каспаз, однако, не всегда ингибирует гибель клетки, индуцированную проапоптическими стимулами. Хотя каспазные ингибиторы блокируют некоторые или все морфологические явления индуцируемыеудалением ростовых факторов,этоносайдом,актиномицином D,ультрафиолетвым облучением,стауроскорином,усиленной c-Myc экспрессиейилиглюкокортикоидами, они не обязательно поддерживают репликативный или клоногенный потенциал. В конечном счете клетки умирают несмотря на неактивацию каспаз путем медленной, неапоптической смерти клеток McCarthy ea 1997,Brunei ea 1998,Amarante-Mendes ea 1998,Hirsch ea 1997.

В противоположность этому, антиапоптические белки, такие какBcl-2белок,Bcl-xL белок и онкогенныйAblмогут поддерживать выживание и клоногеничность перед лицом такого воздействия.

Наоборот, некоторые проапоптические белки, такие какBaxбелок воспалительной смерти клеток, который влияет на митохондриальную мембрану, может индуцировать митохондриальное повреждение и клеточную смерть даже когда каспазы неактивированы Xiang ea 1996. Такие экспериментальные наблюдения доказывают, что независимый от каспаз механизм ввода клеток в смерть существует. Этот механизм похоже включает митохондрии, как мы увидим. См.AIF белок: митохондриальный эффектор апоптоза независимый от каспаз

Митохондрии и апоптоз, незавмсимый от каспаз

Когда умирающая клетка является действительно мертвой и когда она необратимо приговорена к смерти? В последние годы мы пришли к пониманию, что эффекторы апоптоза представлены семейством внутриклеточных цистеиновых протеаз, известных как каспазы.

Ингибиция каспаз, однако, не всегда ингибирует гибель клетки, индуцированную проапоптическими стимулами. Хотя каспазные ингибиторы блокируют некоторые или все морфологические явления индуцируемые удалением ростовых факторов,этоносайдом,актиномицином D,ультрафиолетвым облучением,стауроскорином,усиленной c-Myc экспрессиейилиглюкокортикоидами, они не обязательно поддерживают репликативный или клоногенный потенциал. В конечном счете клетки умирают несмотря на неактивацию каспаз путем медленной, неапоптической смерти клеток McCarthy ea 1997,Brunei ea 1998,Amarante-Mendes ea 1998,Hirsch ea 1997.

В противоположность этому, антиапоптические белки, такие как Bcl-2белок,Bcl-xL белок и онкогенныйAblмогут поддерживать выживание и клоногеничность перед лицом такого воздействия.

Наоборот, некоторые проапоптические белки, такие какBaxбелок воспалительной смерти клеток, который влияет на митохондриальную мембрану, может индуцировать митохондриальное повреждение и клеточную смерть даже когда каспазы неактивированы Xiang ea 1996. Такие экспериментальные наблюдения доказывают, что независимый от каспаз механизм ввода клеток в смерть существует. Этот механизм похоже включает митохондрии, как мы увидим. См.AIF белок: митохондриальный эффектор апоптоза независимый от каспаз

Митохондрии: нарушение электронного транспорта и апоптоз

В течение десятилетий нарушение электронного транспорта считалось первичным признаком смерти клетки. Гамма-облучение вызывает апоптоз в тимоцитах и разрушение цепи электронного транспорта, возможно на стадии цитохром в-с1/цитохром с Scaife ea 1966.

Церамиды, вторичный посредник, задействованный в организации апоптоза разрывает электронный транспорт на одной и той же стадии в клетках, как и в изолированных митохондриях Carcia-Ruiz ea 1997.

Связывание FasсFAS лигандомтакже приводит к нарушению в клетках функции электронного транспорта Adachi ea 1997. Одним из последствий утраты электронного транспорта должно быть падение выработки ATP. Хотя такое падение и наблюдалось при апоптозе, оно часто случается на довольно поздней стадии процесса Bossy-Wetzel ea 1998. В самом деле, ATP повидимому требуется на поздних этапах апоптоза Eguchi ea 1997. Поэтому, хотя потеря митохондриальной выработки ATP может убить клетку, не похоже, что это есть механизм индуцирования апоптоза.

АПОПТОЗ: РОЛЬ ЦИТОХРОМА C, ВЫСВОБОЖДАЕМОГО ИЗ МИТОХОНДРИЙ

Митохондрии: роль высвобождения цитохрома C в апоптозе

Важная роль митохондрий в апоптозе была выявлена в исследованиях бесклеточных систем, в которых спонтанная, ингибируемая воздействием Bcl-2ядерная конденсация и фрагментация ДНК оказались зависимыми от присутствия митохондрий Newmeyer ea 1994. Впоследствии, исследования с другой бесклеточной системой показали, что индукция активации каспазы путем добавки ATP зависит от присутствияцитохрома C, высвобождаемого митохондриями в процессе приготовления экстракта Liu ea 1996. В ходе апоптоза (in vivo и in vitro) цитохром C высвобождается из митохондрии и этот процесс ингибируется присутствием Bcl-2 на этих органеллах Yangn ea 1997,Kluck ea 1997.

Цитозольный цитохром C входит как существенная часть в структуру апоптосомы. Результатом являетсяактивация каспазы-9, которая затем обрабатывает и активирует другие каспазы чтобы организовать биохимическое убийство клеток.

Существенно отметить, что ингибиторы каспаз не предотвращают высвобождение цитохрома C, индуцированное несколькими апоптогенными агентами, включая УФ облучение,стауроскоринисверхэкспрессию Bax Bossy-Wetzel ea 1998,Vander ea 1997,Jurgensmeier ea 1998.

Исключением является выделение цитохрома C из митохондрий, индуцированное представителями рецепторов фактора некроза опухоли - группы FAS, когда выделение цитохрома C предотвращается ингибированием каспаз (главным образомкаспазы-8), подсоединяемых к цитоплазматическому домену лигированного FAS Vander ea 1997. Тем не менее, высвобождение цитохрома С иногда может давать вклад в апоптоз, обусловленный FAS за счет усиления воздействия каспазы-8 на активацию последующих каспаз Kuwana ea 1998.

Картина, которая возникает из этих данных, представляется такой: как только высвобождается цитохром C, клетка приговаривается к смерти или за счет быстрого апоптического механизма включающего активацию каспаз при посредстве Apaf-1или вследствие более медленного некротического процесса, обусловленного коллапсом электронного транспорта, который происходит когда цитохром C удаляется (частично) с митохондрии, что приводит к различным вредным последствиям, включая генерацию оксигенныхсвободных радикалови уменьшение производства ATP .

Последствия высвобождения цитохрома C зависят от типа клеток

Последствия высвобождения цитохрома C зависят от типа клеток. В тех клетках, где цитохром C существует в избытке, каспазы могут быть активированы и еще может остаться достаточное количество цитохрома C привязанного при помощи их высокоактивных контактов к цитохрому b-c и цитохромC-оксидазе, что поддерживает электронный транспорт. В этом случае потребление кислорода и производство ATP может оставаться незатронутым, тогда как каспазы продолжают атаковать цитозольные и ядерные субстраты, что приводит капоптозу.

В противоположность этому в клетках, которые содержат большие количества эндогенных каспазных ингибиторов, высвобождение цитохрома C может не индуцировать зависимый от каспаз апоптоз и вместо этого естественно происходит нарушение цепи электронного транспорта, что может вовлечь клетку на путь некротического разрушения.

Цитохром C: роль в апоптозе: эволюционный аспект

Хотя участие митохондрий и высвобождениецитохрома Cмогут не являться универсальными признаками апоптоза, похоже что они часто встречаются у позвоночных. В противоположность этому, в настоящее время нет свидетельств, что цитохром C играет роль в апоптозе как в нематодах, так и у насекомых. У первых, активация каспаз вследствие взаимодействия сCED-4(чья роль по-видимому аналогична ролиApaf-1) происходит без участия цитохрома C. Более детальный эволюционный анализ поможет установить, явилось ли вовлечение цитохрома C относительно поздней эволюционной инновацией или было ли это впоследствии утеряно в некоторых ветвях развития. Тем не менее, роль митохондрий, как детекторовстрессаи исполнителей экзекуции несомненно весьма важна для поддержания процесса апоптоза в многоклеточных организмах. То-есть, клетки не могут получить преимуществ в развитии, просто отказавшись от митохондрий, потому что эти органеллы также нужны для эффективного энергетического метаболизма, продуцирования мембранных липидов и роста клеток. Дефекты в цепи апоптических явлений ниже митохондрий (например в каспазах) могут также не обеспечить преимуществ в развитии, потому что клетки могут, тем не менее, умереть из- за митохондриальных воздействий (хотя и медленнее), и, таким образом, мутации в каспазах не могут вызвать онкогенез.

Митохондрии: АФК (ROS-активные кислородные соединения) и апоптоз

Митохондрии являются главным источником создания супероксидных анионовв клетках. В ходе транспорта электронов к молекулярному кислороду, в соответствии с оценками, от 1 до 5 % электронов в цепи дыхания теряются, в большинстве своем участвуя в формировании O2. Все, что уменьшает эффективность проводимости в цепи инарушает транспорт электронов, напримернарушение кеточного окислительный (redox) потенциаламожет увеличивать производство супероксидов. Количествосупероксидовиперекисное окисление липидовувеличивается в ходе апоптоза Bredesen ea 1995.

Однако генерация ROSможет происходить на относительно поздней стадии, происходящей после того, как клетка вступила в процессактивации каспаз. В этой связи попытки изучить апоптоз в условияхгипоксиипродемонстрировали, что по крайней мере некоторые проапоптические стимулы работают в отсутствии или почти отсутствии кислорода, что означает что ROS не является единственным "кормильцем" апоптоза Jacobson ea 1995,Shimizu ea 30Sh. Однако ROS могут генерироваться при условиях виртуального анаэробиоза Degli ea 1998и поэтому их роль в апоптозе не может быть отвергнута исключительно на этом основании.

При нарушении наружной мембраны митохондрийиз межмембранного объема выделяетсятермолабильный фактор, вызывающий необратимое превращениексантиндегидрогеназывксантиноксидазу Saksela, ea 1999. Фактор устойчив к ряду испытанныхингибиторов протеаз, включаяингибиторы каспаз,ингибиторы сериновых протеазиингибиторы металлопротеиназ.

Ксантиндегидрогеназакатализирует зависимое от NAD+ окисление ксантина до гипоксантина и последующее окисление гипоксантина до мочевой кислоты. Ксантиноксидаза катализирует те же реакции, но не с NAD+, а с О2 в качестве акцептора электронов. При этом образуются # О2- # Н2О2, а из них -и другиеактивные формы кислорода (АФК), которые разрушают митохондрии и являются мощными индукторами апоптоза. Механизмы образования АФК не ограничиваются ксантиноксидазной реакцией. Главным источником АФК в клетках являются митохондрии. Резкое увеличение АФК происходит при возрастании мембранного потенциала в митохондриях, когда снижено потребление АТР и скорость дыхания лимитируется ADP Korshunov, ea 1997. Цитоплазматическая мембрана макрофагов и нейтрофилов содержит O2- - генерирующую NADPH-оксидазу.

МИТОХОНДРИИ: НАРУШЕНИЕ РАБОТЫ МЕМБРАН ПРИ АПОПТОЗЕ

PT поры во внутренней мембране, разрушение внешней мембраны и апоптоз

Во многих сценарияхапоптоза митохондриальный внутренний трансмембранный потенциалколлапсирует Petit ea 1996, указывая на открытие большого проводящего канала, известного под названием PT поры Qian ea 1997. Структура и состав PT поры остается только частично установленной, но ее составляющие включают как белки внутренней мембраны, такие какадениновый нуклеотидный транслокатор (ANT), и белки внешней мембраны, такие, как зависящий от напряжения анионный канал,VDAC, который работает в местах контактов внешней и внутренней мембран, и образует канал, через который проходят молекулы размером порядка 1.5 kD Petit ea 1996,Bernard ea 1994. Открытие этого канала во внутренней мембране позволяет установить равновесие ионов в матриксе и межмембранном пространстве митохондрии, таким образом распространяя градиент H+ по внутренней мембране и разрывая респираторную цепь.

Что может быть еще более существенно, открытие PT поры приводит к объемной разрегуляции митохондрии из-за гиперосмолальности матрикса, что вызывает увеличение объема матрикса. Из-за того, что внутренняя мембрана, уложенная складками, обладает большей площадью поверхности чем внешняя мембрана, это расширение объема матрикса может очевидно вызвать разрывы внешней мембраны, при которых в цитозоль выделяются активирующие каспазы белки, рапологающиеся внутри межмембранного пространства.Ингибиторы открытия PT-пор, включаяциклоспорины(которые связываютциклофилин D, ассоциированный сANT, и ( bongkrekic acid, кислоту, которая также блокирует ANT), оказывается блокируют апоптоз в некоторых системах, таким образом подтверждая соображение, что PT играет центральную роль в апоптических процессах Zamzami ea 1996.Bcl-2может предотвратить образование PT Zamzami ea 1996в то время какANT активатор атрацтилосидиBaxинициируют какапоптоз, так и образование PT Zamzami ea 1996,Xiang ea 1996.

Другие стимулы, которые прямо не воздействуют на PT поры, такие какоксидантыи патологическийподъем концентрации цитоплазматического кальция, могут индуцироватьразрыв внешней мембраны митохондрииивысвободить белки, активирующие каспазы Susin ea 1996,Susin ea 1997.

Таким образом, во многих случаях PT играет роль дерижера апоптоза. Фармакологические ингибиторы PT пор, как сообщается, предотвращают индукцию апоптоза некоторыми прямыми стимулами Zamzami ea 1996. Однако некоторые исследования свидетельствуют, что высвобождениецитохрома Cи активация каспаз может происходить до какого-либо детектируемого уменьшениямитохондриальный внутреннего трансмембранного потенциала, свидетельствуя что открытие PT пор может происходить на последующих ступенях активации каспаз при посредствеапоптосом Bossy-Wetzel ea 1998,Vander ea 1997. Способностькаспазиндуцировать открытие PT пор Susin ea 1997,Marzo ea 1998, которая, в свою очередь, может индуцировать активацию каспаз (путем высвобожденияцитохрома CиAIF) создает возможности для организации своеобразной цепи усиления и усложняет попытки систематизировать нормальную последовательность шагов в процессе смерти клетки. Высвобождение цитохрома C раньше или в отсутствии уменьшениямитохондриального внутреннего трансмембранного потенциалав некоторых клетках дает основание предположить, что иные регуляторные явления контролируют проницаемость внутренней и внешней митохондриальных мембран. Быстрое открытие и закрытие PT пор в их обратимом состоянии низкой проводимости может разрешить повторяемое, приводимое в действие дыханием, восстановление митохондриальный внутреннего трансмембранного потенциала Ichas ea 1997, так что разрывы внешней мембраны и высвобождение цитохрома C может происходить до коллапса митохондриального внутреннего трансмембранного потенциала.

Разнообразны факторы, вызывающие раскрытие пор Kroemer, ea 1997. К ним относятсяистощение клеток восстановленным глутатионом,истощение клеток NAD(P)H, ATP и ADP,образование активных форм кислорода,разобщение окислительного фосфорилированияпротонофорными соединениями,увеличение содержания Са2+ в цитоплазме. Образованиепор в митохондрияхможно вызватьцерамидом,NO,каспазами,амфипатическими пептидами,жирными кислотами Kroemer, ea 1997. Поры имеют диаметр 2,9 нм, позволяющий пересекать мембрану веществам с молекулярной массой 1,5 кДа и ниже. Следствием раскрытия поры является набухание митохондриального матрикса, разрыв наружной мембраны митохондрий и высвобождение растворимых белков межмембранного объема Skulachev, ea 1998. Среди этих белков - рядапоптогенных белков:цитохром с Liu, ea 1996,Yang, ea 1997,Kluck. ea 1997,прокаспаза 2,прокаспаза 3ипрокаспаза 9 Mancini, ea 1998,Susin, ea 1999,белок AIF.Прокаспаза 3обнаруживается как в межмембранном объеме митохондрий, так и в цитоплазме Mancini, ea 1998.

Митохондрии: разрушение внешней мембраны из-за гиперполяризации внутренней

Предположена возможность существования механизма разрушения внешней мембраны, из-за гиперполяризации митохондриальной внутренней мембраны (в резкой противоположности с гиперполяризацией ассоциированной с открытием PT пор). Временная гиперполяризация наблюдалась в нескольких типах клеток под влиянием различных условий Vander ea 1997и подавляется воздействиемBcl-xL. Как происходит поляризация неясно, тем не менее, увеличенный экспорт протонов в межмембранное пространство может приводить к нейтрализации слабых кислот. Тогда они могут свободно диффундировать сквозь внутреннюю мембрану, и оказываются запертыми, когда протоны удалены. По мере накопления этих метаболитов, осмотическое давление растет, в органеллу поступает вода, что приводит к расширению пространства матрикса и естественно к разрыву внешней мембраны и естественному высвобождению всего содержимого межмембранного пространства. Однако почти все исследования регулировки митохондриального внутреннего трансмембранного потенциала основывались на использовании исключительно катионных липофильных красителей, таких как родамин 123, DiOC6 и другие, чье проникновение сквозь внутреннюю мембрану базируется на наличии заряда. Это кореллирует с другими артефактами, связанными с зарядом, включая автогашение их флуоресценции при слишком большом увеличении внутримитохондриальной концентрации, окислительной дезактивации флуоресценции и др., вызванных скорее изменениями в митохондриальном объеме, чем в изменениями митохондриальныного внутреннего трансмембранного потенциала.

Например, родамин 123 может индуцировать гиперполяризацию этой мембраны после воздействияFas Metivier ea 1998, тогда как другие красители выявляют гиперполяризацию этой мембраны, что заставляет думать, что такая гиперполяризация может быть артефактом Metivier ea 1998.

Хотя разрыв внешней мембраны приводит к выделению цитохрома C, каспаз, AIF и иногда к генерации ROS, только некоторое подмножество митохондрий повидимому подвержены этому Vander ea 1997.

В противоположность этому, исследователи показали что весь (или большая часть) цитохрома C в митохондриях может высвобождаться в процессе апоптоза Yangn ea 1997,Kluck ea 1997, что заставляет думать, что либо методы регистрации разрывов внешних мембран недостаточно чувствительны, либо что высвобождение цитохрома C обеспечивается другими механизмами.

Митохондрии: возможность открытия большого канала во внешней мембране

Альтернативой большим разрывам внешней мембраны теоретически может быть предположено открытие большого канала во внешней мембране, способного вывестицитохром Cили другие белки из межмембранного пространства. Будучи спекулятивной, идея о возможности существования белкового канала привлекательна, поскольку она исключает необходимость разрушения митохондрии, что лучше соответствует наблюдаемой in vivo ненарушенной морфологии митохондрий при апоптозе Wyllie ea 1980.

МИТОХОНДРИИ И БЕЛКИ BCL-2 ПРИ АПОПТОЗЕ

Митохондрии: влияние белков Bcl-2 на их функции

Наличие связи междуапоптозоми физиологией митохондрий следует из присутствия белков семейства Bcl-2 вмитохондриальных мембранах Krajewski ea 1993. Гомолог Bcl-2 у Caenorhabditis elegans,CED-9кодируется бицистронной mRNA, в которой закодирован как CED-9, так ицитохром b Hengartner ea 1994. Это указывает на наличие функциональной связи между белками семейства Bcl-2 и этими органеллами и дает основание думать что CED-9 мог произойти из генома протохондриальных симбионтов, перешедших вместе с другими митохондриальными генами к ядерному геному. Многие, но не все, белки семейства Bcl-2 включаются во внешнюю мембрану митохондрий, прикрепляясь при посредстве гидрофобного участка аминокислот, расположенного в пределах их COOH-групп и так что белки ориентированы в сторону цитоплазмы Krajewski ea 1993.

Были сообщения, что широкий спектр митохондриальных реакций модулируется Bcl-2 и его гомологами. Некоторые из этих реакций некоторые, модулируется агентами, которые прямо воздействуют на митохондрию, такие каколигомицин, который ингибируетF0F1 - adenosine triphosphatase(ATP-азный протонный насос), те протонную накачку митохондриальной внутренней мембраны,цианид, который отравляет окислительное фосфорилирование иBSO, который ингибирует синтез глютатиона Vander ea 1997,Zamzami ea 1996,Marchetti ea 1996,Shimizu ea 1996,Kane ea 1993,Shimizu ea 1996,Hurt ea 1995.

Bcl-2 и Bcl-xL подавляют высвобождение секвестированного матриксом Ca2+, индуцированного супрессорами дыхания Baffy ea 1993.

В изолированных митохондриях Bcl-2 и Bcl-xL увеличивают вывод протонов из митохондрий и увеличивают способностьмитохондрий накапливать Ca2+ Susin ea 1996,Shimizu ea 1998,Белки семейства Bcl-2, возможно, являются каналообразующими

Bcl-2 белки: подобие каналообразующим белкам

Одно из указаний, каким образом белки семейства Bcl-2 вызывают специфические митохондриальные эффекты следует из определениятрехмерной структуры белка Bcl-xL Muchmore ea 1996.

Белок Bcl-xL состоит из семи альфа-спиралей, соединенных гибкими связями и представляющими удивительное сходство с порообразующими доменами некоторых типов бактериальных токсинов - напримертоксин дифтериииколицын. Как следует из их структур,Bcl-2,Bcl-xLиBaxмогут формировать ионные каналы, когда их добавляют к синтетическим мембранам Schendel ea 1997,Minn ea 1997,Antonsson ea 1997,Schlesinger ea 1997. Удаление ответственных за формирование пор альфа-5 и альфа-6 спиралей упраздняет образование каналов в синтетических мембранах при посредстве Bcl-2 и Bax Schendel ea 1997.

Как может маленький канал ионной проводимости, созданный во внешней мембране при посредстве Bcl-2 или Bcl-xL влиять на физиологию митохондрий? Даже в минимальной (замкнутой) конфигурацииVDACобразует поры диаметром, по оценке, 1,5 нанометра Mannella ea 1992. Значит, внешняя мембрана должна быть свободно проницаема для ионов и большинства метаболитов. Bcl-2 и Bcl-xL могут функционально или физически сообщаться с белками внутренней мембраны, которые управляют ионным транспортом, такими как компонентыPT пор, или обеспечивающие ионный транспорт белки, которые управляют регуляцией объема матричного пространства независимо от PT Vander ea 1997.

Bcl-2 и Bcl-xL могут также как-то регулироватьpH межмембранного пространства, приводя к увеличенной скорости выделения протонов из митохондрий Shimizu ea 1998. Цитотоксичность в дрожжах, связанная с Bax и Bax индуцированный апоптоз в клетках млекопитающих требует функционированияF0F1-ATPазной протонной накачки во внутренней мембране митохондрии Matsuyama ea 1998. In vitro данные свидетельствуют о зависимости Bax канала от потенциала и рН Antonsson ea 1997,Schlesinger ea 1997.

Хотя внешняя мембрана митохондрии повидимому не поляризована, ее близкое прилежание к внутренней мембране в области соединительных комплексов может влиять на расположенные там белки.

Bcl-2 белки: механизм не зависящего от каспаз апоптоза

Каков бы ни был биохимический механизм действия белков семейства Bcl-2, их влияние не может быть сведено просто к модели, которая предполагает что антиапоптические гомологи Bcl-2 действуют как супрессоры активирующих каспазы белков, таких как члены семейства CED-4, потому что:

1) белки семейства Bcl-2 регулируют различные явления в митохондрияхдаже в присутствии каспазных ингибиторов широкого спектра действия ( ZVAD-fmk)

2) Bcl-2 могут ингибировать не только зависящий от каспаз апоптоз но также окислительно и гипоксично-индуцированный некроз

3) Bax может индуцировать выделение цитохрома C и клеточную смерть (ингибируемые воздействием Bcl-2/Bcl-xL) даже в дрожжах, где отсутствуют каспазы Xiang ea 1996,Jurgensmeier ea 1998,Hurt ea 1995.

Bcl-2 белки: подобие каналообразующим белкам: эволюционный аспект

Интригующим являетсяструктурное подобие белков семейства Bcl-2сканалообразующими белками, такими какколицины, которые используются бактериями как оружие для убийства бактерий-конкурентов. Эта древняя система, использующая секретированные каналообразующие белки и противоположная иммунным белкам, которые связывают колицины, предотвращая образование каналов, очень напоминает сценарии, развивающиеся в клетках животных, где апоптические стимулы индуцируют транслокацию цитоплазматическогоBaxк митохондриальным мембранам, убивая таким образом клетку, если это не предотвращается Bcl-2. Может быть несколько сот миллионов лет назад либо конвергентные либо дивергентные процессы позволили тому же фундаментальному механизму, который проявляется в водных бактериях, быть включенным в механизм смерти клеток и быть использованным в клетках животных, вводя таким образом митохондрии в число важных участников не только в процессы жизни клеток животных но также и в процессы их смерти.

AIF: фактор, индуцирующий апоптоз по независимому от каспаз пути

Апоптоз(программированная клеточная гибель) может реализовываться и без участия каспаз. Путь апоптоза, независимый от каспаз, запускается при деструкции митохондрии и высвобождении фактора, индуцирующего апоптоз (AIF).

AIF - митохондриальный флавопротеин межмембранной локализации с молекулярной массой 57кДа, состоит из 613 аминокислотных остатков. Ген AIF картирован в локусеXq25-26 Susin ea 1999.

При поступлении апоптотического сигнала происходиттранслокация AIF из митохондрии в цитоплазму, а затем в ядро Daugas ea 2000.

Механизм включения апоптоза посредством AIF состоит в активации эндонуклеазы,расщепляющей ядерную ДНК Daugas ea 2000,Susin ea 2000,Susin ea 1999. AIF, как показано, может и самостоятельно вызывать падениетрансмембранного потенциала митохондрий, конденсацию хроматина и фрагментацию ДНК 347. При действии AIF на изолированные ядра клеток линии HeLa наблюдается конденсация хроматина и фрагментация ДНК. Микроинъекция AIF в интактные фибробласты крыс приводит к снижению мембранного потенциала в митохондриях, быстрой (в течение 1 мин.) конденсации хроматина по периферии ядра и разрыву ДНК на крупные фрагменты длиной 50 т.п.н. и больше. Добавление AIF к изолированным митохондриям печени крыс вызывает высвобождение в растворцитохрома сикаспазы 9 Susin ea 1999. Ни один из этих эффектов AIF не предотвращаетсяингибитором каспазN-бензилокси-карбонил-Val-Ala-Asp-фторметилкетоном ( Z-VAD-fmk), который предотвращает апоптоз, индуцированный в эксперименте цитохромом с. Эти данные доказывают тот факт, что AIF является митохондриальным эффектором апоптоза у животных, действующим независимо от каспаз Susin ea 1999.

Важная роль AIF как медиатора апоптоза была также показана в исследовании на эмбриональных стволовых клетках мышей - клетки с дефицитом AIF устойчивы к апоптозу Cregan ea 2002.

Флавопротеин AIF, будучи добавленным к изолированным ядрам из клеток HeLa, вызывает конденсацию хроматина и фрагментацию ДНК, а при добавлении к изолированным митохондриям печени крыс - высвобождение цитохрома сикаспазы 9 Susin, ea 1999.

Микроинъекция AIF в интактные фибробласты крыс приводит к конденсации хроматина по переферии ядра, разрыву ДНК на крупные фрагменты длиной 50 т.п.н. и больше, диссипациидельта пси в митохондрияхи переходу фосфатидилсерина из внутреннего слоя цитоплазматической мембраны в наружный. Ни один из этих эффектов AIF не предотвращается пептиднымингибитором каспаз Z-VAD.fmk, который предотвращаетапоптоз, индуцированный микроинъецированным цитохромом с. Эти данные показывают, что AIF является митохондриальным эффектором апоптоза у животных, действующим независимо откаспаз Susin, ea 1999.

АПОПТОЗ: ДРУГИЕ МЕХАНИЗМЫ РЕАЛИЗАЦИИ

Апоптоз с участием рецепторного и митохонриального механизмов

В ряде случаев апоптоз реализуется в результате комбинированного действия двух путей - с участием и рецепторов и митохондриального цитохрома с. Так,повреждение ДНКведет к накоплению в клеткебелка p53, который может останавливать деление клеток илииндуцировать апоптоз(см. обзоры Morgan, ea 1997,Agarwal, ea 1998,Bates, ea 1999).

Различные пути апоптоза могут взаимодействовать между собой. В некоторых случаях зависимый от рецепторов путь ведет к малоэффективнойактивации прокаспазы 8. В этом случае подключаетсямитохондриально-зависимый апоптоз: каспаза 8 (образовавшаяся в небольших количествах) взаимодействует в цитоплазме с белкомBidиз семейства Вах, расщепляя его на-двое. С-Концевой домен Bid далее внедряется в митохондриальную мембрану, индуцируя выходцитохрома си его связывание сAPAF-1 Green, ea 1998,Gross, ea 1999.

Апоптоз с участием эндоплазматического ретикулума (ЭР)

Существует путь передачи сигнала апоптоза с участием эндоплазматического ретикулума ( ЭР) Nakagawa, ea 2000,Mehmet, ea 2000. В ЭР локализованапрокаспаза 12. Нарушение внутриклеточного Са2+-гомеостаза добавкойтапсигаргинаили Са2+- ионофорного антибиотикаА23187ведет к апоптозу клеток, вызванномуактивацией каспазы 12. ЭР-Зависимый апоптоз связан сболезнью Альцгеймера: кортикальные нейроны мышей, дефицитных по каспазе 12, устойчивы капоптозу, индуцированному бета-амилоидным белком, но не к апоптозу с участием рецепторов плазматической мембраны или митохондриального цитохрома с.

Апоптоз, вызванный цитотоксическими лимфоцитами

Цитотоксические лимфоциты, Т-киллеры вызывают апоптоз инфицированных клеток с помощью белка перфорина. Полимеризуясь,перфоринобразует в цитоплазматической мембране клетки-мишени трансмембранные каналы, по которым внутрь клетки поступаютTNFp,гранзимы (фрагментины)- смесь сериновых протеаз. Существенным компонентом этой смеси являетсягранзим B- протеолитический фермент,активнирующий каспазу 3 Vaux, ea 1999,Green, ea 1998.

Апоптоз, вызванный нарушением адгезии клеток

Нарушение адгезии клеток индуцирует апоптоз.Интегрины- большое семейство гетеродимерных мембранных белков, которые участвуют в адгезии клеток, связывая внутриклеточный цитоскелет с лигандами внеклеточного матрикса. Большинство интегринов специфически взаимодействует с трипептиднымRGD(аргинин-глицин-аспартат)-мотивом, входящим в состав белков внеклеточного матрикса. Растворимые низкомолекулярныеRGD-содержащие пептиды являются индукторами апоптоза

Апоптоз эритроцитов, сперматозоидов

Особую форму апоптоза претерпевают эритроциты млекопитающих.Эритопоэзсостоит из нескольких этапов. На этапе эритробласта ядро изгоняется (выталкивается) из клетки и пожирается макрофагом Кассирский ea 1955,Албертс ea 1994. Альтернативный вариант:кариорексис(деструкция ядра) с образованиемтелец Жоллии их последующий распад и лизис внутри клетки Кассирский ea 1955. Безъядерная клетка, называемаяретикулоцитом, в дальнейшем теряет митохондрии и рибосомы и превращается вэритроцит. Потерю ядра эритробластом можно рассматривать как особую форму ядерного апоптоза. Выяснение его механизма позволило бы применить его для обезвреживания опухолевых клеток. Эритроцит человека функционирует около 4 месяцев, а затем, поизносившись, исчезает в недрах ретикулоэндотелиальной системы, не причиняя неудобств окружающим клеткам. Лишенный ядра и митохондрий эритроцит, исполнив свое назначение, по-видимому, включает программу гибели, чтобы после этого поступить в распоряжение макрофагов печени и селезенки. Однакоингибитор протеинкиназы стауроспорини ингибитор синтеза белкациклогексимид(индуцируюший апоптоз у большинства испытанных типов клеток млекопитающих) не вызывает апоптоз у безъядерных эритроцитов человека Weil, ea 1996.

Стауроспорин и циклогексимид, а также отсутствие сыворотки в среде инкубации индуцируют гибель эритроцитов цыпленка (содержащих транскрипционно неактивное клеточное ядро) с выраженными признаками апоптоза по пути, который реализуется без участия каспаз.

Сперматозоиды мыши, у которых ядра тоже не обладают активностью в транскрипции ДНК, при инкубации в искусственных средах спонтанно погибают за 1-2 суток; стауроспорин, циклогексимид и пептидный ингибитор каспазz-VAD.fmkне ускоряют и не замедляют клеточную гибель Weil, ea 1998.

Апоптоз: маркеры

Морфологическими маркерами апоптоза являются апоптозные тельцаи сморщенные нейроны с целостной мембраной.

Биохимическим маркером, который стал практически идентичен понятию "апоптоз", считают ДНК-фрагментацию Kihara S., Shiraishi Т. 1994,MacManus J.P., Linnik M.D. 1997,Nitatori Т., Sato N. 1995,Tobita M., Nagano I. 1995. Этот процесс активируется ионамиCa2+иMg2+, а ингибируется ионамиZn2+. Расщепление ДНК происходит в результате действия кальций-магний- зависимой эндонуклеазы. Показано, что эндонуклеазы расщепляют ДНК между белкамигистонами, высвобождая фрагменты регулярной длины Wyllie A.H. 1980,Waters C. 1997. ДНК первоначально делится на большие фрагменты из 50 и 300 тыс. оснований, которые затем расщепляются на составные части из 180 пар оснований, образующие характерную "лестницу" при сепарации гелевым электрофорезом MacManus J.P., Linnik M.D. 1997,Nitatori Т., Sato N. 1995. Однако ДНК-фрагментация не всегда коррелирует с характерной для апоптоза морфологией и является условным маркером, неэквивалентным морфологическим критериям Tomei L.D., Shapiro J.P. 1993,Hockenbery D.M. 1995. Наиболее совершенным для подтверждения апоптоза является биологически- гистохимический метод, позволяющий не только зафиксировать факт ДНК- фрагментации, но и наличие важного морфологического признака -апоптозных телец Gavrieli Y., Sherman Y. 1992.

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Hedgecock E.M., Salston J.E. 1983 , Oppenheim R.W. 1991

2. Thompson ea 1995

3. Steller ea 1997]

4. Kerr J.F.R., Wyllie A.H. 1972

5. Chen S. C., Soares H. D. 1996 , Chopp M., Li Y. 1996 , Sadoul R., Dubois-Dauphin M. 1996

6. Arends ea 1990,Wyllie ea 1980

7. Крыжановский Т.Н., Луценко В.К. 1995 , Deckwerth T.L., Johnson E.M. Jr. 1993 , Martin D.P., Schmidt R.E. 1988

8. Ярилин А.А., «Основы иммунологии», «Медицина»,М.,1999 г.

32