Апоптоз: возможная последовательность этапов

Сигналы апоптоза

Апоптоз является активным процессом саморазрушения клетки, требующим белкового синтеза . Это подтверждено in vivo в опытах по предупреждению смерти нейронов с помощью ингибиторов белкового синтеза Установлен благоприятный эффект инфузии ингибитора протеинового синтеза циклогексимида на выживаемость чувствительных нейронов CA1 зоныгиппокампапосле преходящей ишемии мозга крыс . В то же время существуют данные о том, что апоптоз может проходить и в отсутствие синтеза протеинов de novo .

На первом этапе клетка получает "послание" о том, что она должна пожертвовать своей жизнью для благополучия организма. Это известие приходит из окружающей среды - либо от соседних клеток, либо от межклеточных веществ, твердых или жидких. Чтобы воспринять такое "послание", клетки имеют специальные органы чувств, которые называютрецепторами. Сигнальные молекулы и рецепторы подходят друг к другу, как ключ к замку.Информация передается внутрь клетокчерез различные рецепторы или сочетание рецепторов.

Информацией может являться и отсутствие специфического вещества в окружающей клетку среде. Хорошо известно, что в некоторых случаях молчащий телефон говорит очень о многом.

Существование апоптоза в безъядерных системах ( цитопластах- клетках, лишенных ядра) показывает, что наличие ядра не является обязательным для реализации процесса . Применительно к клеткам животных и человека апоптоз в большинстве случаев связан с протеолитической активацией каскадакаспаз.

Однакоапоптоз возможен и без участия каспаз: сверхсинтез белков- промоторов апоптозаВахиBakиндуцирует апоптоз в присутствииингибиторов каспаз.

Сигналы апоптоза передается внутрь клеток

В результате контакта сигнальных молекул с наружной частью белка-рецептора этот рецепторпретерпевает структурные изменения. Структурная перестройка захватывает и внутриклеточную часть молекулы рецептора. Она может либо обладать определенной ферментативной активностью сама, либо быть тесно связана с некоторыми клеточными ферментами. Изменение структуры рецептора сказывается на работе этих ферментов, поэтому в результате контакта рецептора с внеклеточным веществом внутри клетки происходят разные биохимические изменения.

Часто речь идет об изменении концентрации ионовкальция, а также некоторых относительно мелких фосфорсодержащих органических соединений, относящихся к классу нуклеотидов (смциклические нуклеотиды).

Активные соединения появляются и в результате гидролиза определенных липидов клеточной мембраны. В свою очередь, все это ведет к присоединению или отсоединению остатков фосфата от молекул белковых регуляторов (смфосфорилирование), способных влиять на генетический аппарат клетки.

Фосфорилирование и дефосфорилирование, а также некоторые другие биохимические модификации меняют активность этих регуляторов.

Сигналы апоптоза меняют работу генов

Во втором действии драмы запрограммированной смерти клеток внутриклеточные регуляторы-посланники, получив важные инструкции, вносят поправки в работу отдельных генов. Работа эта, как известно, заключается в образовании РНК, а затем и белков. Таким образом, в результате срабатывания генетической программы, первоначально запущенной сигналом с рецептора, происходит изменение набора внутриклеточных РНК и белков. В конечном счете появляются или активируются ферменты, способные разрушать клеточные белки и нуклеиновые кислоты, их называют протеазами(протеин - белок) и нуклеазами. В заключительном акте клетка теряет свою целостность и становится пищей длямакрофагов.

Клетка анализирует сигналы

Программа, принимающая крайне ответственное и иногда непоправимое решение - жить или не жить, - должна быть предельно осмотрительной, поэтому клетка старается сделать все, чтобы не ошибиться. Перед вынесением окончательного приговора ( активирование разрушающих клетку ферментов) сигналы, получаемые извне, подвергаются всестороннему анализу.

Этот анализ начинается уже на уровне первичных сигналов, получаемых клеткой. Так, в ткани, в которой идет интенсивное клеточное деление, обычно находятся разнообразные белковые вещества, называемыефакторами роста. Эти факторы стимулируют деление. Их отсутствие является либо указанием на то, что потребность в "молодых" клетках уже удовлетворена, либо серьезным сигналом неблагополучия. Разные факторы роста взаимодействуют с разными рецепторами, и клетка часто ориентируется на информацию, получаемую одновременно с нескольких рецепторов. Анализ этой информации внутри клетки происходит при участии многих белков.

Восприятие клетками внешних сигналов происходит, в основном, благодаря взаимодействию некоторых факторов (стимулов, лигандов, " первичных посредников" ) с определенными рецепторами, расположенными на поверхностной мембране клеток. Несмотря на огромное разнообразие стимулов и рецепторов существует всего несколько универсальных сигнальных систем, передающих информацию различным клеточным органеллам и запускающих определенные физиологические процессы в клетке.Гормонысвязываются с рецепторами высокоспецифичным образом и с высокой аффинностью. Связывание гормона с рецептором осуществляется за счет слабых взаимодействий, ионных, ван-дер-ваальсовых и гидрофобных взаимодействий. Специфичность рецептора можно охарактеризовать по его способности распознавать лиганды. Рецептор к инсулину, например, связывает инсулин, но не другие пептидные гормоны.

Способность клеток воспринимать внешние сигналы определяется специальным классом белковых молекул - рецепторами. Рецепторы имеют один или несколько центров связывания сигнальных молекул и проявляют высокое сродство к своим лигандам. Различные клетки живых организмов имеют характерный набор рецепторов в зависимости от выполняемых этими клетками функций. Связываясь с рецептором, внеклеточные химические посредники воздействуют на протекание в клетке - мишени физиологически важных процессов.

Рецепторы - это специальные соединения на поверхности или внутри клеток органа-мишени, которые связываютгормон, доставляемый к его месту действия кровью, и, как следствие такого связывания, индуцируют реакции (илисерию реакций), обеспечивающие конечный эффект гормона.

Гормональные рецепторы являются крупномолекулярными белками, способными нековалентно связывать гормон, и делятся на две группы в зависимости от типа связываемого гормона.

Липофильные гормоны( стероиды), легко проходят через клеточную мембрану, связываются с рецептором, локализованном либо в цитоплазме, либо в ядре клетки. В противоположность

Гидрофильные гормоны, не способные проникать внутрь клетки, связываются срецепторамина поверхности клетки, что обеспечивает запускпередачи сигнала внутри клетки.

Каждый гормон связывается со своим специфическим рецептором.

В одной и той же клетке (и даже в каждой мембране одной клетки) может быть более десятка разных типов рецепторов.

Концентрация рецепторов в клетке крайне низка. В клетках крови число бета-адренергических рецепторов порядка 1000 молекул на клетку.

В настоящее время описаны сотни рецепторов для гормонов, нейромедиаторов, простагландинов, вирусов, бактериальных токсинов, бактерий и простейших организмов.

Большое разнообразие типов и подтипов рецепторов необходимо для обеспечения широкого динамического диапазона физиологических ответов и высокой информационной емкостисигнал-передающих путей(). Важную роль в обеспечении необходимой гибкости сигнальных путей играет различие в сродстве к лигандам у различных типов рецепторов. Так, например, бета1- и бета2-адренорецепторы, обладая 54% сходством, способны дифференцировать такие лиганды, как адреналин и норадреналин.

Связывание каждого гормона с рецептором - процесс, как правило, независимый от состояния других рецепторов.

Гормоны, близкие по химической структуре, могут связываться с одним и тем же рецептором. (см. примеры:рецептор часто взаимодействует с разными гормонами)

Закономерности связывания с рецепторами всех агонистов оказываются общими. Кинетика связывания гормона с рецептором определяется законом действующих масс.

В большинстве случаев рецепторы являются белками,чаще гликопротеидами. Известны и исключения, так рецептором холерного токсина является моносиалоганглиозид Gm1.

Прокаспазы: активация: общие сведения

Неактивные предшественники каспаз - прокаспазы присутствуют во всех клетках. Активация прокаспаз у млекопитающих осуществляется аналогомced-4 гена-возбуждающим фактором апоптозной протеазы-1 (Apaf-1). Интересно, что Apaf-I имеет место связывания для ATP, что подчеркивает значимость уровня энергетического обеспечения для выбора механизма смерти (энергозависимогоапоптозаили энергетически независимогонекроза). При возбуждениикаспазымодифицируют активность клеточных белков (полимераз, эндонуклеаз, компонентов ядерной мембраны), ответственных за фрагментацию ДНК в апоптозных клетках. Активированные ферменты вызывают разрушение цитоплазменных белков, начинают расщепление ДНК, что приводит к появлению в местах разрывов трифосфонуклеотидов. Клетка теряет воду и уменьшается в размерах, снижается рН цитоплазмы. Клеточная мембрана утрачивает свои свойства, клетка сморщивается, образуются апоптозные тельца. В основе процесса перестройки клеточных мембран лежит активация сирингомиелазы, которая расщепляет сирингомиелин клетки с высвобождением керамида, активирующего фосфолипазу A1. Происходит накопление продуктоварахидоновой кислоты. Экспрессированные в ходе апоптоза белкифосфатидилсеринивитронектинвыходят на поверхность клетки и сигнализируют макрофагам, осуществляющим фагоцитозапоптозных телец.Прокаспазы обладают незначительной протеолитической афосфатидктивностью, составляющей 1-2% активности зрелой каспазы .

Будучи в мономерной форме, прокаспазы, концентрация которых в клетке ничтожна, находятся в латентном состоянии. Предполагается, что пространственное сближение молекул прокаспаз при их агрегации ведет к образованию активных каспаз через механизм протеолитического само- и перекрестного расщепления (ауто- или транс-процессинга) В результате от прокаспазы (молекулярная масса 30-50 кДа) отделяется регуляторный N-концевой домен (продомен), а оставшаяся часть молекулы разделяется на большую (~20 кДа) и малую (-10 кДа) субъединицы . Затем происходит ассоциация большой и малой субъединиц. Два гетеродимера образуют тетрамер каспазы с двумя каталитическими участками, действующими независимо.

В результате действия каспазпроисходит следующее:

активация прокаспаз с образованием каспаз; расщепление антиапоптозныхбелков семейства Всl-2.

Подвергается протеолизу ингибитор ДНКазы, происходитфрагментация ДНК.(Однако,Апоптоз возможен и без фрагментации ДНК.)

гидролиз белковламинов, армирующих ядерную мембрану, конденсация хроматина;

разрушение белков, участвующих в регуляциицитоскелета;

инактивация и нарушение регуляции белков, участвующих врепарацииДНК,сплайсинге мРНК,репликации ДНК.

Мишенью каспаз являетсяполи (ADP-рибозо) полимераза (ПАРП).

Прокаспаза 8 (FLICE/MACH/Mch5): активация

Активация прокаспазы 9

Последовательность действия про- и антиапоптозных сигналов

Предполагаются следующие пути передачи про- и антиапоптозных сигналов Ashkenazi, ea 1998.

На этапеактивации каспаз первого эшелонажизнь клетки еще можно сохранить.

Существуют регуляторы, которые блокируют ( ингибиторы апоптоза) или, напротив, усиливают разрушительное действиекаспаз первого эшелона( промоторы апоптоза) (см. обзоры ). В результате действия промоторов апоптозапрокаспаза 8 активируется,

Каспаза 8активируеткаспазу второго эшелона (эффекторную каспазу): путем протеолиза из прокаспазы 3 образуетсякаспаза 3, после чего процесс, запущенный программой смерти, оказывается необратимым. иллюстрирует взаимодействие между каспазами первого и второго эшелона. Каспаза 3 способна в дальнейшем к самостоятельной активации (автокатализу или автопроцессингу), она активирует ряд других протеаз семейства каспаз ифактор фрагментации ДНК, что ведет к необратимомураспаду ДНК на нуклеосомальные фрагменты. Так запускается каскад протеолитических ферментов, осуществляющих апоптоз.

АПОПТОЗ: ФАЗА ЭКЗЕКУЦИИ

Апоптоз: фаза экзекуции внеядерная: введение

Фаза экзекуции является активной фазойапоптоза, происходящей немедленно после того, как в клетке включается программа самоуничтожения. Она длится около часа и характеризуется яркимиморфологическими проявлениями апоптоза(т.е. блеббингом мембраны, конденсацией хроматина и фрагментацией ДНК). Кульминацией является разрушение клетки и упаковка ее для фагоцитоза. Большинство исследований фазы экзекуции фокусировалось на выяснении ядерных изменений с идентификацией механизмов, ответственных за ядерную экзекуцию - таких как связь между выделениемцитохрома С,активацией каспазы 9/3ифрагментацией ДНК. .

Изучение цитоплазматических или внеядерных явлений задерживалось. Однако в течение конца 90-х гг понимание соответствующих механизмов и биохимических процессов привело к значительному росту интереса по отношению к явлениям, происходящим вне ядра в процессе фазы экзекуции. Несмотря на возникший интерес к внеядерной фазе экзекуции, на первый взгляд разные исследования кажутся относительно разрозненными. Однако если разделить фазу экзекуции на три последовательные фазы, почти все данные, полученные по явлениям внеядерной фазы экзекуции могут быть описаны в относительно логичной схеме.

В модели, которую мы предлагаем, первойстадией является высвобождение(release). При вхождении большинства клеток в фазу экзекуции, они высвобождают прикреплениявнеклеточного матрикса(ЕСМ) и реорганизуютфокальную адгезию(FA), приобретая более округленную морфологию. Эти наружные изменения коррелируют с потерейстрессфибрилл(если таковые имеются) и реорганизацией актина в переферийные (кортикальные) связанные с мембраной кольцевые пучки. Разборкамикротрубочектакже происходит на этой стадии.

Вторая стадия-стадия блеббинганачинается с сокращения актинового кольца связанного смиозином IIс последующим периодом продолжительного впячивания и выпячивания плазменной мембраны. Это продолжается до тех пор, пока клетка не входит в стадию конденсации.

Третия стадия конденсациихарактеризуется трансформацией клетки в маленькиеапоптические телаили в одиночный сжатый шарик, коррелируя с растворением полимеризованного актина.

АПОПТОЗ: ФАЗА ЭКЗЕКУЦИИ: ФАЗА ВЫСВОБОЖДЕНИЯ

Апоптоз: фаза экзекуции: фаза высвобождения: введение

Первая фаза в большинстве клеток претерпевающих апоптоз состоит в открепленииЕСМ(внеклкточного матрикса) и округлении. Процесс наиболее драматично выражен в распластанных клетках, которые обладают четкими прикреплениями матрикса и наличиемстрессфибрилл, таких какфибробласты,эпителиальныеиэндотелиальные клетки. Процесс наименее ярко выражен в клетках со слабыми прикреплениями матрикса, таких как лимфоциты. Фаза высвобождения была частично понята в эндотелиальных клетках, где сильные периферийно-латеральныеFA комплексы (фокальной адгезии)разбираются одновременно с реконструкциейфокальных контактовпрямо под округлившейся клеткой.

Одновременно, актин перестраивается в форме периферийного кольца в преддверии блеббинга.

Ингибированиеполимеризации актинапри помощи малых концентрацийцитохалазина Dподдерживает распластанное состояние при наличии стимулов к апоптозу, что заставляет предположить что реорганизация актина является существенным моментомАкойния(апоптоз, обусловленный откреплением матрикса) представляет прямое вхождение в стадию высвобождения. В акойнийных клетках передача сигнала при помощиFA киназы фокальной адгезииразрушена , что приводит к изменениям в различных цепях передачи ключевых сигналов