Власні дослідження

Джерелом інфекції є хворі птиці. До зараження найбільш сприйнятливі курчата 2-тижневого віку, причому курочки більш чутливі, чим півні. Виділення віруса експериментально зараженою птицею відбувається через 7-21 день після інфікування. У птиці, що має клінічні ознаки хвороби, вірус постійно виявляється в крові. З організму він виділяється через органи дихання і травлення, а також через пір'яні фолікули. Аерогенний шлях розповсюдження. інфекції є основним.

У лабораторію надсилають 5-10 клінічно хворих кур­чат, від яких для дослідження відбирають кров та пір'я з фолікула­ми, шматочки уражених органів (печінки, нирок, яєчників, серця, легень, фабрицієвої сумки, тимуса), шкіри, м'язів, периферичних нервів плечового і крижово-сідничного сплетень. Із уражених орга­нів готують 10%-ву суспензію, яку після відповідної підготовки ви­користовують для зараження 10 - 12-денних курячих ембріонів, пе­рвинних культур клітин або одноденних курчат.

Для ідентифікації вірусу використовують РІФ.

Реакція імунофлюресценсії (ріф) (Метод флюоресціюючих антитіл)

Суть реакції полягає у взаємодії антигенів з міченими флюорохромом антитілами, в результаті чого виникає світіння при люмінесцентній мікроскопії. Для мічення антитіл використову­ють найчастіше ФІТЦ (флюоресцеїнізотіоціанат), який зумов­лює люмінесценцію зеленого кольору.

Прямий метод РІФ

Компоненти реакції:

1) досліджуваний вірус (мазки-відбитки або гістозрізи з пат-матеріалу хворих тварин, препарати з зараженої культури клі­тин);

2) флюоресціюючі специфічна і нормальна сироватки;

3) намічені специфічна і нормальна сироватки;

4) препарати з органів здорових тварин або незараженої культури клітин.

Постановка реакції:

1. Препарати висушують на повітрі, фіксують 10-15 хв. в охо­лодженому ацетоні (-10-15°С).

2. На препарати наносять флюоресціюючу специфічну сироватку, витримують ЗО хв. у вологій камері при кімнатній тем­пературі або в термостаті при 37°С (в залежності від виду віру­су).

3. Препарати відмивають 0,01 М ФБР (рН 7,2-7,4) тричі по 10 хв. і ополіскують дистильованою водою.

4. Препарати висушують на повітрі і досліджують у люміне­сцентному мікроскопі, застосовуючи нелюмінесціюючу олію для імерсії.

5. Результати реакції оцінюють у плюсах за інтенсивністю і специфічністю флюоресценції досліджуваного об'єкта при чіткій морфології клітин:

++++ - яскраве світіння смарагдово-зеленого кольору;

+++ - яскраве світіння зеленого кольору;

++ - слабке світіння жовто-зеленого кольору;

+ - дуже слабке світіння невизначеного кольору; - - відсутність флюоресценції.

6. Реакція вважається позитивною, якщо в препараті вияв­ляється не менше 3-5 уражених вірусом клітин, які флуоресціюють яскраво-зеленим кольором на три-чотири плюси (в ре­зультаті утворення комплексів антиген-антитіло). Флюоресценція буває дифузною і гранулярною в залежності від виду вірусу і стадії його нагромадження в клітині

7. Одночасно ставлять контролі:

- незаражені клітини, оброблені флуоресціюючою специфіч­ною сироваткою;

- заражені клітини, оброблені флуоресціюючою нормаль­ною сироваткою;

- заражені клітини, оброблені спочатку неміченою специфіч­ною сироваткою, а потім флуоресціюючою специфічною сиро­ваткою;

- заражені клітини, оброблені спочатку неміченою нормаль­ною сироваткою, а потім флуоресціюючою специфічною си­роваткою [3].