Общая характеристика действия излучений на биологические объекты.

Радиация и наследственность человека.

Цитогенетические эффекты облучения рассматривают отдельно для зародышевых и для соматических клеток.

Для зародышевых клеток эти эффекты состоят в образовании гамет с измененным набором хромосом. Это выражается в гибели зигот, эмбрионов и плодов в разных стадиях развития (несостоявшаяся беременность, самопроизвольные аборты, мертворождения), или в рождении детей с хромосомными болезнями. Поэтому, одним из показателей действия радиации на половые клетки человека является частота рождения больных с хромосомными болезнями. Можно считать, что число хромосомных больных до известной степени отражает частоту мутационных актов. Однако, фактический материал пока еще недостаточен и противоречив.

Дело в том , что генетические дефекты от облучения невозможно отличить от тех, которые возникли совсем по другим причинам. Около 10% всех живых новорожденных имеют те или иные генетические дефекты, от дальтонизма, многопалости и до синдрома Дауна, хореи Гентингтона и других пороков развития.

Протекание естественного мутационного процесса более чем в 1500 локусах, вызывающих определенные наследственные заболевания, обусловило такое накопление «вредных» мутаций в популяциях человека, что каждый человек несет в своем генотипе в гетерозиготном состоянии как минимум 2-3 вредные мутации.

Накопление мутаций привело к тому, что выщепление гомозигот по рецессивным мутациям и эффект доминантных мутаций обусловливает появление в каждом поколении людей около 4% детей, страдающих наследственными болезнями.

Значительная часть естественных мутаций у человека, равная приблизительно до 6%, обусловлена действием естественного фона радиации. Многочисленные эксперименты на животных позволили выявить количественную зависимость появления наследственных заболеваний от дозы облучения. Удваивающая доза находится в диапазоне 0,5 - 2,5 Зв.

Вводя ряд поправочных коэффициентов, оценивают риск генетических повреждений и для человека. При облучении в 1 Зв достаточно большой популяции людей следует ожидать на тысячу новорожденных появление 3-6 с генетическими повреждениями. При больших дозах соответственно будет возрастать и число неполноценных младенцев.

Данные о действии радиации на геном соматических клеток не имеют прямого значения при оценке генетических последствий облучения для будущих поколений. Однако они очень важны для прогнозирования вреда непосредственно для облученного индивидуума, т.к. определенно показана роль облучения в таких отдаленных последствиях, как злокачественные новообразования и раннее старение.

При облучении наиболее часто возникает лейкемия, рак легких, рак груди у женщин. Остальные виды рака (печени, желудка и пр.) наблюдаются значительно реже. Обычно между облучением и заболеванием проходит значительное время – 15-20лет. Вероятность радиогенного рака зависит не только от дозы облучения, но и от других причин, действующих в этот длительный период между облучением и заболеванием. Выявлено, что воздействие на облученный организм многих канцерогенных веществ, присутствующих в окружающей нас среде даже в таких количествах, которые сами по себе безвредны, во много раз увеличивает вероятность заболевания раком.

Пример: курение увеличивает вероятность рака легкого в 2 раза (~30 сигарет в день). Шахтеры урановых рудников имеют незначительную вероятность заболевания раком легких, однако у курильщиков-шахтеров она возрастает уже в 10 раз.

Генетическое действие ионизирующих излучений.

Мутагенное действие ионизирующей радиации впервые было установлено советскими исследователями Г.А.Надсоном и Г.С.Филиповым в 1925г в опытах на дрожжах. В 1927г это открытие было подтверждено Г.Меллером на классическом генетическом объекте – дрозофиле.

Дальнейшие исследования показали, что ионизирующие излучения способны вызывать все виды наследственных перемен или мутаций: геномные, хромосомные мутации или хромосомные аберрации и точковые или генные мутации.

Спектр мутаций, индуцированных ионизирующими излучениями, не отличается от спектра спонтанных мутаций.

Генные мутации. На основании количественного учета генных мутаций была установлена зависимость частоты их возникновения от дозы облучения. Показано, что частота летальных мутаций в половых клетках исследованных лабораторных животных возрастает прямо пропорционально дозе ионизирующего излучения:

N/N_o = k·D, где

N_o – число спонтанных мутаций; N – общее число мутаций за вычетом контроля;

D – доза облучения; k – коэффициент пропорциональности возрастания мутаций.

Графическое выражение этой зависимости показывает, что экстраполяция теоретической кривой построенной по экспериментальным точкам проходит через нулевую точку координат. Это свидетельствует о том, что любая сколь угодно малая доза ионизирующей радиации приводит к повышению частоты мутаций по сравнению с уровнем спонтанных мутаций.

Последние исследования, проведенные на облученных мышах, показали, что между индукцией первичного повреждения и его конечной реализацией имеет место репарация, и что удлинение экспозиции или фракционирование дозы значительно уменьшают выход мутаций.

Реализованные генные мутации, однажды возникнув, могут иметь стойкий характер вследствие конвариантной редупликации ДНК. Они передаются во всех последующих клеточных поколениях или сохраняются во временно не размножающихся клетках.

Хромосомные мутации. В результате действия ионизирующей радиации на хромосомы возникает большое количество хромосомных перестроек. Разные типы хромосомных перестроек по-разному зависят от дозы.

Прямыми цитологическими исследованиями показано, что возникновение хромосомных аберраций зависит от плотности ионизаций. Излучения с меньшей энергией и большей плотностью ионизации более эффективно вызывают хромосомные перестройки.

Таким образом, корпускулярные излучения вызывают хромосомные перестройки чаще, чем электромагнитные.

Показано, что облучение , например, дрозофилы в атмосфере чистого кислорода повышает частоту мутаций, а облучение в атмосфере азота снижает частоту обнаруживаемых мутаций.

Эти явления подтверждают положение о том, что хромосомные перестройки возникают в результате обратимого нарушения в ядре клетки, вызванного облучением. Во время воздействия ионизирующей радиации на ядро клетки могут возникать истинные и потенциальные разрывы хромосом. Последние, в зависимости от условий, складывающихся в клетке после облучения, могут реализоваться в истинные разрывы или совсем не реализоваться. Количество фиксированных мутаций определяется двумя факторами: количеством первичных повреждений хромосом, возникающих в момент радиационного воздействия, и вероятностью перехода первичного изменения в конечную мутацию.

С другой стороны, в научной литературе по проблемам действия малых доз радиации растет число публикаций о том, что при действии «очень малых доз» радиации, отмечается снижение уровня мутаций по сравнению с исходным (спонтанным, фоновым).

Например, по данным Х.Старла(1982) для клеток млекопитающих доза снижающая спонтанный уровень мутаций лежит в области 0,02Гр. При дозе 0,05Гр он уже отмечал повышение уровня аберраций хромосом в лимфоцитах крови по сравнению с нормой. По другим данным, на растительном объекте (скерда) доза снижающая уровень аберраций хромосом составляет величину порядка 0,05 – 0,1Гр.

Эти авторы склонны объяснять снижение количества мутаций в клетках индукцией «очень малыми дозами» излучений процессов молекулярной репарации ДНК.

Итак, принципиальной разницы в механизме действия радиации на соматические и зародышевые клетки нет. Одинаково поражаются и те и другие. Однако исходы поражений разные.

Когда повреждаются зародышевые клетки, возникающие мутации (генные, хромосомные) с той или иной скоростью, зависящей от степени доминантности и от степени снижения жизнеспособности, элиминируются из популяции. Эта элиминация далеко не всегда бывает быстрой. Многие мутации, особенно рецессивные, в результате различных генетических процессов, таких как, например, дрейф генов или эффект родоначальника, могут заметно размножаться в популяциях. Это может приводить к увеличению случаев врожденных уродств, аномалий обмена и т.д..

Мутационные события в соматических клетках могут привести к гибели клеток (клеточные летали) или выразиться в приобретении клеткой новых наследственных свойств, выводящих ее из под контроля организма. Это находит свое выражение в процессах малигнизации.

Как уже отмечалось выше, с точки зрения сторонников беспорогово-линейной гипотезы бластогенеза (канцерогенеза) при «малых дозах» облучения даже одной мутации в проонкогенном локусе ДНК достаточно, чтобы вызвать опухоль. Так как такую мутацию может вызвать 1 квант атомной радиации, то отсюда следует, что любые, как угодно малые дозы повышают риск лучевого канцерогенеза. И если мы не можем доказать это экспериментально, то только потому, что требуется слишком большая величина выборки.

Однако, исследования последних лет показали полную необоснованность подобных рассуждений. Прежде всего, в настоящее время уже общепризнанно, что малигнизация – многоступенчатый процесс. Возникновение мутаций должно произойти не в одном, а по крайней мере, в 7 локусах, дающих информацию для синтеза различных полипептидов, являющихся ростовыми факторами для деления клетки. Уже одно это снимает теоретическое обоснование беспороговости лучевого канцерогенеза.

Доступная литература: (2) – стр.60, 189-190, 219-221; (9) – стр.60-62, 236-239, 259-262; (10) – стр.109-112, 346-353

Лекция 8

Теоретические представления о механизме биологического действия ионизирующих излучений.

При анализе основных этапов формирования взглядов на природу радиобиологического эффекта можно выделить два основных направления.

Первое выражается в стремлении установить общие количественные закономерности, которые характеризуют самые первичные («пусковые») звенья радиобиологических реакций. Это теоретическое направление объединяет гипотезы, составляющие основу количественной радиобиологии.

Второе пытается объяснить все многообразие сложных лучевых реакций биологических объектов от момента поглощения энергии и до проявления конкретных радиобиологических эффектов. Отсюда преимущественно качественный (описательный) характер объединяемых в этом направлении гипотез.

Из количественных концепций мы рассмотрим основанную на принципе попаданий теорию мишеней, стохастическую гипотезу и вероятностную модель радиационного поражения клетки, а из качественных – гипотезу первичных радиотоксинов и цепных реакций и структурно-метаболическую гипотезу.

Принцип попаданий и теория мишеней.

Исторически первыми были сформулированы два положения, которые легли в основу наиболее ранних теоретических представлений в радиобиологии, получивших название классического формализма. Первое из них – принцип попаданий (Ф.Дессауэр, Д.Ли) – основан на дискретности событий поглощения энергии, квантованности взаимодействия излучений с веществом, вероятностности распределения поглощаемой энергии в пространстве. Второе – принцип мишени (Д.Ли, Н.В.Тимофеев-Рессовский, К.Циммер) – учитывает высокую в физическом и функциональном отношении гетерогенность клеточных структур.

Родоначальником классического формализма можно считать английского физика Ф.Дессауэра, который в 1922 году изложил свои представления о том, что хотя облучаемый биологический объект в целом получает ничтожную суммарную энергию, в его микрообъемах она поглощается в огромном количестве, но в виде отдельных порций (квантов), приводя к микролокальному разогреву и изменениям в этих микрообъемах; отсюда и ее название – гипотеза точечного тепла. Учитывая наличие в клетке более существенных для жизни и менее существенных структур и микрообъемов, а также чисто случайное распределение «точечного тепла», Дессауэр пришел к выводу о том, что исход клеточной реакции зависит от случайных попаданий дискретных порций энергии именно в жизненно важные микрообъемы – мишени.

В основу принципа мишени положено представление о том, что структура и функции живой системы неравноценны, гетерогенны и различаются в ответах на одно и то же попадание. Если радиация «одинаково безразлична» к облучаемым субстратам («не выбирает» их), то повреждение отдельных элементов биологических систем имеет неодинаковую значимость для судьбы клетки.

Исходя из принципов попадания и мишени, была предложена теория мишени. В этой теории в качестве клеточных мишеней рассматриваются высокочувствительные объемы, лучевые повреждения которых могут быть ответственны за летальные исходы.

В соответствии с принципами теории мишени количество попаданий должно быть прямо пропорционально дозе излучения. Поэтому в определенном диапазоне доз число пораженных мишеней строго пропорционально дозе, или числу попаданий, т.к. поражается лишь некоторая их часть из общего количества. В связи с этим кривая зависимости эффекта от дозы имеет вид прямой. С повышением дозы излучения вероятность поражения одной и той же мишени несколькими попаданиями увеличивается вплоть до того, что число попаданий может превысить общее число мишеней. Поэтому, хотя общее число попаданий остается пропорциональным дозе, их эффективность уменьшается, и количество пораженных мишеней возрастает медленнее, асимптотически приближаясь к 100%. При этом кривая зависимости эффекта от дозы для доли выживших мишеней будет экспоненциальной.

Наиболее простой способ проверки экспоненциальной кривой, получаемой в эксперименте, состоит в логарифмировании числа выживших объектов на ординате; если при этом получается прямая линия, то проверявшаяся экспериментальная кривая выживания действительно экспоненциальная.

Для простейшего случая «одноударного процесса», когда попаданием считают одиночный перенос некоторого количества энергии, тестируемый эффект наступает тогда, когда определенное количество энергии поглощено чувствительной областью – мишенью.

Рассмотрим математическое обоснование соответствия «одноударной» модели принципам теории мишени.

Пусть, облучаемая система состоит из N₀ объектов; N – число объектов, не пораженных дозой D.

В этом случае выход из строя определенной доли объектов dN/N₀ при приращении дозы dD выразится уравнением: dN/N₀ = dD/D₀, где D₀ – доза, при которой на каждый объект приходится в среднем одно попадание (D₀ – среднелетальная доза). При интегрировании данного уравнения получаем:

In(N/N₀) = -D/D₀; N = N₀·е^{– D/Dº}.

При D = D_0, выполняется соотношение:

N/N₀ = е^-1 = 0,37, т.е. выживает 37% облученных клеток, а 63% гибнет.

Это соответствует распределению Пуассона; так как при дозе D₀ часть попаданий приходится в уже погибшие клетки, то 37% клеток не испытывают ни одного попадания.

В природе чаще встречается другой тип кривых, характерных для большинства клеток растительного и животного происхождения. В нормальных координатах они имеют S-образную форму. При рассмотрении таких зависимостей с позиций теории попаданий приходится говорить о «многоударном процессе», имея в виду, что для инактивации нужно не одно, а два и более попаданий в мишень, или поражение двух и более мишеней.

При изображении такой кривой в полулогарифмических координатах она приобретает «плечо», переходящее в прямолинейный участок, наклон которого совпадает с наклоном соответствующей одноударной кривой. Экстраполированием прямолинейного участка к нулевой дозе, на оси ординат отсекаются отрезки, соответствующие «ударности» мишеней или их числу, обозначаемому через «n» и называемому экстраполяционным числом.

Возможность строгого применения теории мишени уже в самом начале ее зарождения была ограничена основоположниками (Ли,1946) областью анализа одноударных эффектов.

Во всех других случаях и, в частности, при анализе многоударных кривых теория мишеней требует многих допущений, а поэтому, как правило, неприменима.

Теория мишени в ее классическом виде бессильна объяснить действие облучения на сложные биологические объекты:

1)Так как инактивация по экспоненциальной кривой получается лишь в исключительных случаях;

2)Очень часто не выполняется и другое условие для признания одноударного механизма – независимость эффекта от мощности дозы;

3)Неудачной оказалась попытка связать «мишень» с реальными или гипотетическими структурами клетки, полностью объяснить с позиции теории мишени генетическое действие ионизирующего излучения;

4)Оказалось, вместе с тем, что форма кривой «доза-эффект» не есть нечто постоянное, она меняется при разных условиях облучения, например, в зависимости от рН, или температуры, а это означает, что размеры мишени разные;

5)В рамки теории мишени не укладывается, что после облучения возможны процессы восстановления, или напротив усиления поражения;

6)С классической теорией мишеней несовместимо доказательство наличия в живых организмах косвенного действия радиации;

7)С позиций теории мишени невозможно объяснить кислородный эффект при действии ионизирующих излучений.

Однако отказ от теории мишени, как общей теории биологического действия ионизирующих излучений, не означает отрицания возможности прямого действия излучения и признания того, что в клетках и организмах могут быть менее и более чувствительные к облучению структуры и системы.

Все это обусловило появление в конце 60-х годов новой количественной гипотезы – стохастического действия излучений, призванной «изложить теорию попаданий на основе стохастического принципа».

Стохастическая гипотеза.

Эта гипотеза рассматривает любой биологический объект, в частности клетку, как лабильную динамическую систему, постоянно находящуюся в состоянии перехода из одного состояния в другое, Вследствие крайней сложности системы любой такой переход сопровождается и связан с множеством комплексных и элементарных сопряженных реакций отдельных клеточных органелл и макромолекул. В процессе жизнедеятельности, благодаря влиянию самых разнообразных, не подлежащих учету факторов и малейших неопределенностей исходного состояния, возникает вероятность «отказов» в элементарных звеньях, а вследствие этого и/или независимо от них – «крушения» всей системы. Поэтому, любое критическое событие, например митоз или гибель клетки, можно предсказать лишь с известной неточностью. Зная это и стремясь к достижению желаемой точности, обычно оперируют средними значениями вероятности события. Таким образом, любым критическим событиям в живой нативной системе свойственна некая изначальная биологическая стохастичность.

На биологическую стохастичность (вероятность) первого порядка при облучении объекта накладывается стохастика второго порядка вследствие случайного взаимодействия излучения с веществом, что резко увеличивает вероятность «крушений» системы, происходящих со значительно меньшей скоростью и в необлученном контроле.

Мишенями в этом случае служат все компоненты живой системы, а регистрируемая реакция обусловлена взаимодействием самых различных первичных пусковых событий.

Первая особенность стохастической гипотезы – то, что она учитывает как физиологические, так и индуцированные облучением процессы. Вторая (проистекающая из первой) очень важная особенность стохастической схемы – ее стремление описать кинетику индуцированных излучением изменений в динамическом аспекте.

Таким образом, стохастическая концепция предлагает простую, но более «биологическую» интерпретацию кривых доза-эффект по сравнению с их объяснением с позиций теории попаданий, хотя ее основная мысль, что эти кривые определяются в основном случайной природой абсорбции энергии, остается незыблемой.

При анализе дозовых кривых с учетом функциональной лабильности биологических объектов, стохастическая гипотеза приводит нас к выводу о том, что экспоненциальная кривая указывает на систему без компенсаторных механизмов, а сигмоидная соответствует системам, обладающим такими механизмами, эффективность которых исчерпывается при возрастании дозы облучения. Экстраполяционное число же следует рассматривать как количественное выражение компенсационной способности облучаемого объекта, а не как число «мишеней». Естественно, что роль восстановительных процессов в конечном эффекте должна усиливаться с уменьшением мощности дозы.

Для количественного учета фактора времени и связанных с ним восстановительных процессов предложены специальные уравнения, дающие возможность рассчитать дозовые кривые.

В последнее время произведены расчеты некоторых результатов с использованием рекомендуемых количественных характеристик, и при этом оказалось, что для инактивации клеток млекопитающих редкоионизирующим излучением в среднем необходимо совместное действие не менее четырех событий абсорбции.

Однако, за пределами объяснений данной гипотезы остался большой круг явлений, прежде всего из области модификации радиобиологического эффекта. Неясно, как использовать новую гипотезу для интерпретации результатов радиационно-генетических экспериментов. Концепция биологической стохастики не позволяет объяснить зависимость биологического эффекта от ЛПЭ.

Вероятностная модель радиационного поражения клетки.

Вероятностная модель радиационного поражения клетки предложена Ю.Г.Капульцевичем в 1978г. на основе анализа количественных закономерностей различных реакций дрожжевых клеток на облучение. В предлагаемой модели принцип попаданий дополняется предположением о вероятностном характере повреждений.

Согласно этой модели разные клетки, подвергнутые облучению в одной и той же дозе, поражаются в разной степени в соответствии с принципом попадания, но в отличие от классических представлений, и потенциальные, и реализованные повреждения проявляются с вероятностью меньше единицы. В тех случаях, когда вероятность проявления повреждения равна единице, вероятностная модель переходит в классическую одноударную модель. При количественном анализе экспериментальных данных, который ограничивается средними характеристиками популяции облученных клеток, вероятностная модель зачастую приводит к таким же результатам, как и многоударная. Следовательно, классические модели теории попаданий можно считать частными случаями вероятностной модели, проявляющимися при определенных ограничениях.

Главное отличие вероятностной модели от классических представлений состоит в том, что согласно последним радиочувствительность клетки определяется лишь объемом мишени и критическим числом попаданий. С позиций же вероятностной модели проблема радиочувствительности представляется более сложной. Процесс радиационного поражения клетки предлагается формально разделить на три этапа.

Первый этап – осуществление событий попадания, в результате которых формируются первичные потенциальные повреждения. Вероятность образования первичного повреждения на единицу дозы излучения зависит от величины эффективного объема (V) и от величины энергии, необходимой для образования первичного повреждения. Поскольку, отнюдь не всякое выделение энергии в эффективном объеме может привести к образованию первичного повреждения, то клетка, по-видимому, способна восстанавливаться от него еще на стадии формирования потенциальных повреждений. Итак, на этой стадии радиочувствительность определяется величиной эффективного объема и вероятностью (p) образования потенциального повреждения при локальном выделении в эффективном объеме энергии «Е». Оба эти параметра (V и p) могут зависеть как от биологических особенностей объекта, так и от условий облучения, например, от температуры, влажности, концентрации кислорода и т.п.

Второй этап радиационного поражения – реализация потенциальных повреждений. Так как клетки способны восстанавливаться, то реализованными оказываются не все возникшие потенциальные повреждения, а лишь часть их (r). Следовательно, радиочувствительность клетки определяется и вероятностью реализации потенциального повреждения. Все три параметра ( V,p,r ) определяют частоту «b» реализованных повреждений на единицу дозы излучения b=V·p·r и среднее число «а» реализованных повреждений при дозе «D», т.е. а = b·D. С помощью параметра «b» вероятностная модель учитывает зависимость радиобиологических эффектов от дозы излучения, ЛПЭ и продолжительности восстановления.

Третий этап радиационного поражения – различные вторичные нарушения нормального протекания внутриклеточных процессов, вызываемые реализацией повреждений. По-видимому, и на этом этапе возможно восстановление клеток от последствий реализованных повреждений или их компенсации. Поэтому вероятность проявления данного реализованного повреждения не равна единице, а характеризуется величиной α, которая зависит от биологических особенностей клетки и от условий культивирования.

Таким образом, радиочувствительность клетки, о которой мы судим по кривой выживания, определяется четырьмя параметрами ( V, p, r и α ) достаточными, однако, не только для описания формы кривой, но и всего разнообразия проявления действия излучений на репродуктивную способность клеток, зависимости радиобиологических эффектов от условий культивирования клеток и физических характеристик излучения.

Таковы достоинства рассмотренной вероятностной модели, которую можно считать логическим звеном в развитии количественной радиобиологии.

Однако, ни сама модель, ни производимый с ее помощью анализ реакций клеток на облучение не позволяют выявить природу повреждений, лежащих в основе этих реакций, ибо для этого необходимы специальные методы исследования. Кроме того, нельзя забывать, что сделанные выводы справедливы для изученных эффектов только применительно к дрожжевым клеткам.

Доступная литература: (9) – стр.108-124; (10) – стр.158-169

Лекция 9