2. Заиолнс'ние колонки

Колонку укрепляют строго вертикально, закрывают нижний кран и наливают на 1/3 ее объема дистиллированной воды. Освобождают про-

1. i рансгво иод диском от пузырьков воздуха. Через воронку наливают в мшонку густую, тщательно взмученную взвесь сефадекса так, чтобы жид­кость стекала по стенке колонки и не увлекала в свою толщу пузырьки иошуха. Суспензии дают осесть; через несколько минут открывают кран и продолжают наполнение колонки, постепенно подливая следующие пор­ции извеси. Во избежание слишком сильного уплотнения сорбента запол­нение колонки производят при небольшом давлении (особенно важно сле­ши I. за этим при работе с гелем сефадекс). Давление определяется как |ппница между уровнем жидкости над сорбентом в колонке (или присое­диненном к ней верхнем резервуаре) и положением конца шланга, по ко- мрому элюат вытекает из колонки. Необходимо следить за тем, чтобы на­полнение колонки было равномерным.

'Заполнив колонку до нужной высоты, закрывают нижний кран (за- *им) и дают суспензии осесть, не допуская “высыхания” наполнителя в mi.тике (для этого над верхним слоем сорбента всегда должен находиться

• юй растворителя). Следят также за тем, чтобы верхний слой наполнителя имел :ладкую, горизонтальную поверхность. Для уменьшения взмучива­ния верхнего слоя при внесении в колонку образца над ним иногда поме- цып > | кружок фильтровальной бумаги или поролона.

После заполнения колонку уравновешивают элюирующим раство­рим, н качестве которого используют 0,1% раствор NaCl.

Для уравновешивания колонки через нее пропускают 1,5 объема

2. к - и i.i (от объема колонки).

Определение свободного объема колонки

Для определения свободного объема колонки (V₀) через нее про-

10. n i к .но I 200 мкл 0,2% раствора голубого декстрана.

1. олубой декстран представляет собой высокомолекулярный полиса- ||>м I (Мм. = 2000000 Да), содержащий хромофорную группу, которая

• 11<и i.u-1 ему синий цвет. Молекулы этого соединения настолько велики, •по не проникают внутрь геля.

I'acrnop голубого декстрана вносят в колонку следующим образом. < начата-удаляют раствор элюента с поверхности геля, оставляя слой в 1-2 мм Ну операцию удобно проводить с помощью пипетмана. Затем на по­верхность геля осторожно наслаивают образец голубого декстрана, ис- пош.чуя тог же пипетман. После этого открывают нижний кран-зажим и mini впитаться образцу в гель, затем кран вновь открывают. Сверху на поверхность наполнителя аккуратно наслаивают около 5 мл элюента.

После нанесения образца колонку соединяют с капилляром, транс- поршрующим свежий элюент. (Не следует прикладывать особых усилий во избежание поломки колонки). Включают насос и открывают кран- i.i/«V им. Сразу же начинают собирать фракции элюата. Для этого подклю­чаю! коллектор фракций.

Вытекающий из колонки элюат собирают в пробирки порциями по

1. мл. Регистрацию объема элюата, прошедшего через колонку, начинают с момента нанесения образца на колонку.

Измеряют оптическую плотность фракций, содержащих голубой декстран, при 650 нм. Перед измерением каждую фракцию разводят в

2. раза свежим элюентом, так как в кювету необходимо вносить не менее

2. мл жидкости.

Строят профиль элюирования голубого декстрана. Для этого вычер­чивают график, на горизонтальной оси которого откладывают номера пробирок (фракций) или объем, прошедший через колонку жидкости, а на вертикальной оси - величины оптической плотности фракций. Свободный объем определяется как объем элюата, вышедшего из колонки с момента нанесения образца декстрана до максимального его выхода.