Техника безопасности

При работе на центрифуге соблюдать правила техники безопасности при работе с центрифугой, изложенные в документации на рабочее место № 4 "Работа на центрифуге”. Перед включением проверить исправность вилки, розетки, шнура и наличие заземления.

При выполнении операций на спектрофотометре руководствоваться инструкцией на рабочее место № 5 "Спектрофотометр СФ-4”. Перед включением проверить исправность вилки, розетки, шнура и наличие за­земления.

В работе используется трихлоруксусная кислота (ТХУ). Она пред­ставляет собой бесцветный гигроскопический порошок: Т _пл = 59,2 °С, t_K„„. = 197.5 °С. р< - 1.6171. Легко растворим в воде, спирте, эфире. Сильная кислота. Проникает через кожу. При попадании в глаза вызывает помутнение роговицы, проходящее через 13-18 дней. ПДК 5 мг/м ’. Инди­видуальная зашита: зашита глаз и кожи (перчатки, маски). Спецодежда. При попадании на кожу смыть большим количеством воды. При попада­нии в глаза промыть водой, обратиться к врачу. При остром отравлении промыть желудок, покой, свежий воздух, вызвать врача.

Лабораторная работа № 2 солевое фракционирование белков

Этот метод очень широко используется в биохимии при очистке ферментов. Различные белки выпадают в осадок при разной концентрации соли. Постепенное увеличение ее концентрации дает возможность полу­чить ряд отдельных фракций с преимущественным содержанием в одной из них выделяемого фермента.

Для солевого фракционирования чаще всего используется хорошо растворимый в воде сульфат аммония. Растворимость его мало изменяется в области температуры от 0 до 30 °С. Сульфат аммония не оказывает вред­ного воздействия на ферменты, а большинство из них - стабилизирует. Ес­ли нежелательно увеличение объема ферментного раствора, используют твердую соль, предварительно измельчив ее в ступке, но раствор при я ом закисляется. Можно использовать насыщенный раствор сульфата аммония, что особенно удобно на последних стадиях очистки. Предвари­тельно pH раствора сульфата доводят до требуемого значения, что исклю­чает необходимость контроля и доведения pH ферментного раствора в процессе его фракционирования. Сульфат аммония вносят в раствор от­дельными порциями, при перемешивании. Если используют твердую соль, то последующую порцию добавляют только после полного растворения предыдущей. Тщательное перемешивание и дробное добавление предот­вращают локальное повышение концентрации соли выше требуемой, что могло бы привести к загрязнению выделяемой фракции. После растворе­ния последней порции сульфата аммония (или добавления последней пор­ции насыщенного раствора) перемешивание продолжают 15-20 минут, чтобы получить более четкое разделение фракций. Для формирования осадка белка фракции выдерживают при 4 "С (в холодильнике) в течение 30 мин и более (иногда несколько часов). Образовавшиеся осадки отделя­ют центрифугированием или фильтрованием.

Концентрация соли, необходимая для перевода фермента в осадок, швиситот его концентрации, наличия различных примесей. Существенное влияние оказывает также природа используемой для фракционирования соли, а также pH среды и температура. Для четкого воспроизведения ре- !\ льтатов необходимо соблюдать условия проведения данной стадии.

Концентрацию сульфата аммония в растворе выражают десятичной дробью (полное насыщение при >том принимают равным 1,0) или в про­центах насыщения. Насыщенный раствор имеет 100% насыщение, что со­ответствует 4,05 М раствору сульфата аммония.

Количество сульфата аммония (в г), которое необходимо добавить при 20 °С для получения заданной степени насыщения, рассчитывают по формуле

„ 0.533 4' (С;-Ci)

1-0.3-Cl

где V - объем исходного раствора с концентрацией сульфата аммония, равной С| насыщения; С₂ - требуемая степень насыщения.

Концентрацию сульфата аммония в данном случае выражают деся­тичной дробью.

При фракционировании насыщенным раствором сульфата аммония добавляемый его объем (V) находят по формуле

“l-C:

где С; - исходная, а О - требуемая степень насыщения ферментного рас­твора сульфатом аммония, выраженные десятичной дробью; У₀ - исход­ный объем ферментного раствора.

Целью данной работы является выделение из клеток дрожжей Candida utilis ВКМ У-750 и частичная очистка высаливанием с помощью сульфата аммония цитохрома Р₄₅₀, участвующего в начальном окислении углеводородов в составе монооксигеназной системы.