Определение этилового спирта

5. Химико-токсикологическое исследование биологических проб (кровь, моча, слюна)

на наличие алкоголя

Как указывалось выше, исследование биологических жидкостей на наличие и количественное определение этилового спирта прово­ дится только в случае тяжелого состояния пострадавшего, конфлик­ тных ситуаций и на основании личного заявления граждан.

Правила отбора

Результаты химического исследования биожидкостей на при­ сутствие этилового спирта во многом зависят от соблюдения мето­ дики их отбора, условий хранения, транспортировки и погрешности используемого метода.

Регламентация отбора биожидкостей с целью определения эти­ лового спирта приводится в методических указаниях «Химико-ток­ сикологический анализ веществ, вызывающих одурманивание», в Приказе МЗ РФ от 5 октября 1998 г. № 289 «Об аналитической диагностике наркотических средств, психотропных и других ток­ сических веществ в организме человека» и методических указаниях «Медицинское освидетельствование для установления факта упо­ требления алкоголя и состояния опьянения» от 1 сентября 1988 г. № 06-14/33-14 с изменениями, внесенными Приказом МЗ РФ от 12 августа 2003 г. № 399, в Приказе МЗСР РФ от 27.01.2006 г. № 40 «Об организации проведения химико-токсикологических исследо­ ваний при аналитической диагностике наличия в организме чело­ века алкоголя, наркотических средств, психотропных и других ток­ сических веществ».

81

Моча

Моча отбирается в чистый сухой стерильный пенициллиновый флакон «под пробку». Флакон закрывается стандартной резиновой пробкой, которую фиксируют алюминиевым колпачком.

Процедура отбора пробы мочи должна проводиться под наблю­ дением медицинского персонала для предупреждения замены или порчи пробы. При получении пробы мочи следует провести предва­ рительный анализ, который заключается в определении температу­ ры, рН, цвета, мутности.

Температура должна находиться в пределах 32,5—37,7 °С, рН мочи в норме должно быть в интервале 4—8, визуально проба должна выглядеть естественной.

Если результаты предварительного исследования вызывают по­ дозрение в фальсификации, персонал обязан провести повторную процедуру отбора пробы в условиях, исключающих фальсификацию.

При отсутствии возможности повторного отбора проводят хи­ мическое исследование имеющейся пробы мочи на присутствие креатинина и мочевины (19), которые составляют основную массу малорастворимых в ней азотсодержащих органических соедине­ ний (Кисин М. В. с соавт., 1973; Кисин М. В. с соавт., 1998). При отрицательном результате анализа исследование повторяется.

Методика. Часть жидкости концентрируют с помощью роторно­ го испарителя или нагреванием на водяной бане до получения ми­ нимального объема концентрата, и 2 мкл полученного концентрата наносят на хроматографическую пластинку с закрепленным слоем силикагеля или кремневой водной кислоты, а также на готовые хроматографические пластинки «Сорбфил». Параллельно на пластинку наносят 0,01%-й раствор креатинина и мочевины в физиологичес­ ком растворе или свежая кровь.

Хроматографирование осуществляют в системе н-бутанол: уксусная кислота: вода (4:1:2). Длина пробега фронта растворителей 150 мм.

Обнаружение креатинина и мочевины проводится последова­ тельной обработкой высохшей пластинки двумя реактивами: йодом и п-диметиламинобензальдегидом.

После исчезновения запаха уксусной кислоты пластинку поме­ щают в герметичную камеру, на дно которой находится кристалли-

82

ческий йод. Через 4—5 минут на пластинке образуется пятно серова­ того цвета, переходящее в коричневый цвет с Rf = 0,25, соответству­ ющее по окраске и значению Rf креатинина.

После этого пластинку выдерживают на воздухе в течение 15—

20минут и опрыскивают раствором п-диметиламинобензальдегида. При наличии в исследуемой пробе мочи на хроматограмме наб­

людается желтое пятно с Rf = 0,46, соответствующее по окраске и

значению Rf мочевине.

Приготовление раствора п-диметиламинобензальдегида (п-ДМБА). 1 г п-ДМБА растворяют в 30 мл воды очищенной. Полученный раствор добавляют к 10 мл концентрированной хлористоводородной кислоты и добавляют до 100 мл воды очищенной, нагретой до 100 °С.

Слюна

Слюна отбирается в сухой стерильный флакон из-под пеницил­ лина в количестве 5 мл. Флакон закрывается стандартной резиновой пробкой, которую фиксируют алюминиевым колпачком.

Кровь

Перед отбором пробы крови в сухой стерильный флакон из-под пенициллина закапывают 1—2 капли гепарина или 0,8 мл 3,8%-го раствора цитрата натрия и встряхиванием флакона смачивают его внутреннюю поверхность.

Кровь в количестве 5 мл отбирается из поверхностной вены че­ рез иглу самотеком во флакон, обработанный гепарином или цитра­ том. Флакон закрывается стандартной резиновой пробкой, которую фиксируют алюминиевым колпачком. Содержимое флакона сразу же перемешивают.

Категорически запрещается обрабатывать кожные покровы в мес­ тах укола спиртом, диэтиловым эфиром, настойкой йода. Место укола следует обрабатывать раствором риванола (1 : 500) или раствором фурациллина (1 :5000).

У флаконов с отобранными пробами фиксируют резиновые проб­ ки алюминиевыми колпачками с помощью приспособления для обжи­ ма колпачков, обеспечивающего герметизацию флакона, и ставят их в холодильник. В случае герметизации другим способом флаконы долж­ ны быть опечатаны. На каждый флакон наклеивается этикетка с указа-

83

нием номера пробы, даты, времени забора пробы, фамилии освидетельствуемого, фамилии медицинского работника, подготовившего пробу.

В Приказе МЗ РФ № 289 указывается, что для отправки в хими­ ко-токсикологическую лабораторию биологическую жидкость от освидетельствуемого помещают в два флакона. Первый образец пред­ назначен для анализа, а второй — «контрольный образец», который ставится на хранение и используется для повторного анализа пробы в случае необходимости (при повторной экспертизе, по требованию правоохранительных органов, при необходимости использования более совершенных методов анализа и др.). К флаконам крепятся ярлыки с шестизначным кодом обследуемого и дату.

В лабораторию биопробы доставляются с направлением, в ко­ тором указываются порядковый номер пробы, наименование био­ жидкости, количество, дата, время взятия биопробы, цель анализа, фамилия, имя, отчества врача и организация, откуда поступило на­ правление с объектом исследования.

При доставке образцов проб в химико-токсикологическую ла­ бораторию производится наружный осмотр и устанавливается факт отсутствия нарушений в целостности упаковки. Контрольные образ­ цы хранят в запираемый и опечатываемый холодильный шкаф при температуре —18 "С. Срок хранения образца — 2 месяца со дня пос­ тупления в лабораторию. Если в течение этого срока отсутствовала необходимость в повторном химико-токсикологическом анализе, то по истечении 2 месяцев образец уничтожают.

Известно, что в крови человека содержится определенное коли­ чество этанола (эндогенный алкоголь).

Р. В. Кудрявцев с соавторами (1981) обследовали 115 доброволь­ цев, которые перед взятием крови не употребляли спиртных напит­ ков не менее 10 суток. При этом испытуемые не придерживались специальной диеты, получая обычное, нормальное питание.

Концентрацию этилового спирта в крови определяли газохроматографическим методом при непосредственном введении пробы биожидкости в хроматограф.

На основании экспериментальных данных, представленных на рис. 23 установлено, что у 87,9% обследованных добровольцев кон­ центрация эндогенного этанола составляла ниже 0,02%о.

84

При длительном хранении биосред с нарушением температур­ ного режима хранения в них развиваются бродильные и гнилостные процессы, которые могут существенно исказить результаты количес­ твенного определения.

Интенсивность образования этанола в биологических объектах зависит от ряда факторов, в частности от наличия микрофлоры и уровня глюкозы.

Согласно экспериментальным данным, полученным Ф. А. Галицким (1985, 1995), при ряде физиологических и патологических состояний в процессе хранения образцов крови и мочи в течение 10 суток в комнатных условиях (+18 °С + 3 °С) происходит образова­ ние этанола. Автором приводятся следующие данные:

—при ишемической болезни сердца в 75% у больных в образцах мочи происходит образование этанола, максимальная концентрация которого составляла 8,75%о;

—у беременных, особенно во втором и третьем триместрах бе­ ременности, в 60% случаев максимальная концентрация этанола в моче достигала 2,76%о;

—у детей в 61 % образцов мочи наблюдали образование этанола в концентрации до 8,54%о;

—после воздействия экстремальных факторов образование эта­ нола в образцах мочи произошло в 60% в концентрации до 5,7%о;

—в крови образование этанола наблюдали в 28,2% в концентра­ ции не превышающей 0,5%о.

Указанное образование этилового спирта в крови и моче, по мне­ нию Ф. А. Галицкого, обусловлено гликемией и глюкозурией вследс­ твие значительных нарушений углеводного обмена при ишемичес­ кой болезни сердца, при беременности, у детей, улиц после воздейс­ твия экстремальных факторов.

Эти выводы отчасти подтверждаются результатами исследо­ ваний A. W. Jones et al. (1999) которые отмечают, что при хране­ нии проб мочи, содержащей глюкозу в концентрации 0,5% или 1% и инфицированной дрожжами Candida albicans при +22 °С в течение 2 дней, происходило новообразование этилового спирта

вконцентрации до 0,25 г/л. Через 8 дней содержание этанола в присутствии глюкозы 0,5% и 1,0% достигало 2,1 и 4,5 г/л. При

86

снижении температуры до 4 °С и при добавлении натрия фторида (в концентрации 1% или 2%) образование алкоголя не происхо­ дило.

Исследование крови, мочи и слюны

Обнаружение и количественное определение этилового спирта в биологических жидкостях в химико-токсикологических лаборато­ риях наркологических диспансеров проводится газохроматографическим методом по методике, утвержденной Министерством здра­ воохранения РФ.

Ниже приводится методика, разработанная А. А. Колдаевым и рекомендованная к использованию методическими указаниями Минздрава СССР от 1 сентября 1988 г. № 06-14/33-14 «Медицинское освидетельствование для установления факта употребления алкого­ ля и состояния опьянения» с изменениями, внесенными Приказом МЗ РФ от 12 августа 2003 г. № 399.

Обнаружение этилового спирта и его структурных аналогов — алифатических спиртов (метилового, пропиловых, бутиловых и амиловых) проводится не по нативной молекуле, а по их сложным эфирам с азотистой кислотой (алкилнитритам).

Исследование биожидкостей на присутствие этилового спирта алкилнитритным методом осуществляется на газовых хроматогра­ фах (ЛХМ-8 МД, ЛХМ-80, «Цвет-100, 102, 106, 162», MX, MXK и других), в комплектацию которых входит детектор по теплопровод­ ности — катарометр. Для разделения алкилнитритов применяется колонка стальная длиной 2 м и внутренним диаметром 3 мм, запол­ ненная 20% ПЭГ-1500 на ИНЗ-600, модифицированным серебром. Температура колонки, инжектора и детектора 60 "С. Скорость газаносителя гелия 24 мл/мин; запись хроматограмм производится на потенциометре КСП-4, скорость диаграммной ленты — 240 мм/час. Детектор-катарометр, ток моста детектора 100 ма.

Методика обнаружения этилового спирта в биологических пробах

Во флакон из-под пенициллина, содержащий 0,5 мл 50%-го рас­ твора трихлоруксусной кислоты, вносят 0,5 мл следуемой пробы. Флакон закрывают стандартной резиновой пробкой и помещают в

87

герметически закрывающийся металлический контейнер для фикса­ ции пробки в горловине флакона.

Содержимое флакона перемешивают и во флакон через пробку шприцем вводят 0,35 мл 30%-го раствора нитрита натрия. Смесь энергично встряхивают (30 маятникообразных движений) и оставля­ ют на 1 минуту. Шприцем отбирают из флакона 0,5 мл газообразной пробы, которые тотчас вводят в хроматограф. Обнаружение этилнитрита, который образуется в результате реакций I и II, осуществляется по абсолютному времени удерживания.

NaNO, + CCLCOOH -> HNO, + CCLCOONa (I)

C2HsOH + HN02 -> C2H5ONO + H20 (II)

Этилнитрит

С помощью секундомера измеряют время удерживания (t^) от начала выхода пика несорбируемого компонента (смеси воздуха и оксидов азота) до максимума измеряемого пика.

Для идентификации пика(ов), наблюдаемого(ых) на хроматограмме, достаточно вычислить относительное время удерживания (t ) по формуле (4) и сравнить полученную величину с данными, представленными в табл. 8.

1 *

*— при вышеуказанных условиях хроматографирования;

**— изопропиловый спирт — внутренний стандарт.

88

Количественное определение

Количественный анализ проводят по методу внутреннего стан­ дарта, используя для расчета отношение высот пика этанола к пику изопропанола (или н-пропанола).

Во флакон из-под пенициллина, содержащий 0,5 мл 50%-го рас­ твора трихлоруксусной кислоты, вносят 0,5 мл изопропанола (внут­ ренний стандарт) и 0,5 мл исследуемой пробы. Флакон закрывают резиновой пробкой и помещают в герметично закрывающийся ме­ таллический контейнер для фиксации пробки в горловине флако­ на. Содержимое флакона перемешивают и во флакон через пробку шприцем вводят 0,35 мл 30%-го раствора нитрита натрия. Смесь энергично встряхивают и оставляют стоять 1 минуту. Шприцем от­ бирают из флакона 0,5 мл газообразной пробы, которую тотчас вво­ дят в хроматограф.

Для получения достоверных результатов проводят три параллель­ ных исследования.

Концентрацию этилового спирта определяют путем вычисления отношения высот пиков этилнитрита и изопропилнитрита (н-про- пилнитрита) с последующей интерполяцией из калибровочного гра­ фика (рис. 24) зависимости отношения высот пиков этилнитрита к высоте пика изопропилнитрита (или н-пропилнитрита), построен­ ному раздельно для крови, мочи и водных растворов.

При построении графиков используют стандартные растворы этилового спирта в крови и моче в концентрациях от 0,4 до 2,0%о и от0до4,0%о.

Стандартные растворы этилового спирта в крови и моче готовят из исходного 2%-го водного раствора этанола. Для приготовления стандартного раствора, содержащего 1,0%о этилового спирта, пипет­ кой отмеривают 2,5 мл 2%-го раствора спирта, количественно пере­ носят в мерную колбу вместимостью 50 мл и объем доводят кровью или мочой до метки (при 20 °С); для приготовления 3,0%о-го раство­ ра берут 7,5 мл,адля4,0%о-гораствора— 10 мл 2%-го раствора спир­ та и смешивают в мерной колбе вместимостью 50 мл с кровью или мочой, как указано выше. Стандартные растворы хранят в склянках темного стекла с тщательно притертыми пробками при температуре +2 — +6 "С. Перед открыванием склянку необходимо тщательно

89