МЕТОДИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ

К практическому занятию n 8. 4 курс 1 семестр тема: «исследование продуктов пол и показателей антиоксидантной системы защиты. Определение малонового диальдегида, активности каталазы, кдз»

МЕСТО ПРОВЕДЕНИЯ: 26 кабинет. ВРЕМЯ ЗАНЯТИЯ: 180 минут.

В соответствии с Государственным образовательным стандартом после изучения раздела «Обмен липидов в норме и патологии» медицинский лабораторный техник должен уметь:

• проводить исследование продуктов ПОЛ;

• проводить исследование показателей антиоксидантной системы защиты организма;

• интерпретировать полученные результаты исследования;

• заполнять бланк анализа.

должен знать:

• образование, химический состав, обмен транспортных форм липидов: ХМ, ЛОНП, ЛНП, ЛВП;

• сущность ПОЛ, его значение;

• пути нарушения обмена липидов − нарушение переваривания и всасывания, нарушения

ПОЛ,жировая дегенерация печени, гиперлипопротеинемии.

ЦЕЛИ: 1. Подготовиться к формированию умения оценки ПОЛ и антиоксидантной защиты.

2. Систематизировать знания о механизмах и значении ПОЛ и антиоксидантной защиты.

3. Повторить технику безопасности при работе в биохимической лаборатории;

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ

1. Понятие и сущность перекисного окисления липидов.

2. Механизм ПОЛ, роль в организме. Нарушения ПОЛ.

3. Активные формы кислорода, механизм их образования. Роль цитохрома Р₄₅₀ в их

образовании.

4. Антиоксидантные системы организма: неферментативные и ферментативные. Механизмы их

функционирования.

5. Витамины Е, А, РР, аскорбиновая кислота. Роль в организме и механизм антиоксидантного

их действия.

6. Конечные продукты ПОЛ, влияние на организм.

7. Действие каталазы. Принцип определения, ход определения, клинико-диагностическое

значение определения активности каталазы эритроцитов.

8. Принцип определения, ход определения, клинико-диагностическое значение определения

содержания малонового ангидрида.

9. Характеристика жирных кислот. Пути распада жирных кислот в организме.

План самостоятельной работы на занятии

1. Подготовка реактивов.

2. Составление схем исследований.

3. Определение малонового диальдегида.

4. Определение активности катадазы эритроцитов крови.

5. Оформление бланков анализов.

6. Трактовка результатов.

7. Приведение в порядок рабочих мест.

ПОСЛЕ ЗАНЯТИЯ СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:

• проводить исследование продуктов ПОЛ;

• проводить исследование показателей антиоксидантной системы защиты организма;

• интерпретировать полученные результаты исследования;

• заполнять бланк анализа.

ЛИТЕРАТУРА ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ

1. В.К. Кухта. Основы биохимии. М. 1999.

2. Методическое пособие к занятию ( взять у лаборанта, переписать).

3. Материалы лекции.

МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ К ЗАНЯТИЮ ПО ОСНОВАМ БИОХИМИИ С МЕТОДАМИ КЛИНИКО-БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ №8.

ТЕМА: «ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОДУКТОВ ПОЛ И ПОКАЗАТЕЛЕЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ ЗАЩИТЫ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ. КДЗ»

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ МАЛОНОВОГО ДИАЛЬДЕГИДА (ТБК- АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ) В ЭРИТРОЦИТАХ КРОВИ

Малоновый диальдегид является конечным продуктом перекисного окисления, которое индуцируется высокореактивными свободными радикалами: супероксидионом, гидроксидионом, атомарным кислородом, синглетным кислородом. Перекисному окислению в большей степени подвергаются липиды, в меньшей степени белки, НК. Перекисное окисление липидов (ПОЛ) является свободно-радикальным процессом, инициация кото­рого происходит при образовании активных форм кислорода — супероксид иона О₂*; гидроксильного радикала НО*; гидропероксидного радикала НО₂*; ^-O₂ — синглетного кислорода; гипохлоритного иона CLO^-.

Основными субстратами ПОЛ являются полине­насыщенные высшие жирные кислоты (ВЖК), на­ходящиеся в структуре фосфолипидов мембран. На разных стадиях пероксидации ВЖК образуются диеновые и триеновые конъюгаты, пероксиды ВЖК (R-OO*), гидроперекиси ВЖК (R-OOH), эндоперекиси, малоновый диальдегид и новые свободные ради­калы. Сильнейшим катализатором процесса явля­ются ионы металлов (Fe2+). Процесс обрывается при образовании продуктов, не содержащих сво­бодных радикалов.

ПОЛ — это физиологический процесс, который имеет важное значение для орга­низма, так как регулирует проницаемость мембран, влияет на деление и рост клеток, начинает фагоци­тоз, является путем биосинтеза некоторых биоло­гически активных веществ (простагландинов, тромбоксанов, лейкотриенов).

Контроль за физиологи­ческим уровнем ПОЛ осуществляет мощная антиоксидантная система, включающая неферментные антиоксиданты (токоферол, аскорбиновая кисло­та, Р-каротин, мочевая кислота, убихинон), а также анти-оксидантные ферменты (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза, церулоплазмин). Антиоксиданты способны пре­кращать ПОЛ или нейтрализовать продукты ПОЛ. Снижение активности антиокси-дантов или высокая активность прооксидантов (эндо- или экзогенных) могут привести к неконтролируемому ПОЛ, повреж­дению клеточных структур и гибели клетки.

Интенсификация ПОЛ приводит к развитию мно­гих патологических процессов: последствий радиа­ционных поражений, осложнений при гипероксигенации и гипоксии, опухолей. Пероксидация ЛНП являет-ся одной из причин развития атеросклероза. Образование активных форм кислорода (АФК) идет в реакциях в присутствии оксидаз:

оксидаза

1 ) О₂ + е О₂^- (супероксидион);

2 ) О₂^- + е О₂^-2 (пероксидион (Н₂О₂);

3 ) О₂^- + Н₂О₂ О₂ + ОН^- + ОН' (свободный гидроксильный радикал);

4 ) ОН' + О₂ -> ОН- + ¹О₂ (синглетный кислород)

Реакция 2 и 3 теперь могут повторяться без АФК, они делаются цепными реакциями.

В физиологических условиях ПОЛ обеспечивает быстрое изменение структуры и свойств мембран клеток и цитотоксические реакции при фагоцитозе. В обычных условиях интенсивность ПОЛ незначительна, так как ограничивается антиоксидантной системой (супероксиддисмутаза, каталаза, витамины А, Е, С, РР, рибофлавин, цистеин, метионин, мочевина, селен, цинк, марганец, медь и углекислый газ).

При уменьшении поступления с пищей антиоксидантов, стрессе, тяжёлой физической нагрузке, гипоксии, курении, облучениях и с возрастом ПОЛ усиливается. Это приводит к нарушению целостности мембран клеток, нарушению их транспортной функции и другим нарушениям, в частности является пусковым механизмом атеросклероза.

Принцип метода: основан на образовании окрашенно­го комплекса при взаимодействии малонового диальдегида с тиобарбитуровой кис­лотой.

Реактивы. 1. ТХУ - 170 г/л.

2. Тиобарбитуровая кислота (ТБК) - 8 г/л.

3. Хлорид натрия, изотонический, 0,15 моль/л (9 г/л).

4. Трилон Б (ЭДТА) -1%.

Ход определения.

Кровь отбирают в комплексонат калия (трилон Б), 1 мл несвертываемой крови центри­фугируют 10 мин при 1000 об/мин. Плазму сливают или отсасывают пипеткой Пастера. К эритроцитам добавляют 3 мл охлажденного физиологического рас­твора, смесь осторожно перемешивают стеклянной палочкой и центрифуги­руют. Так повторяют трижды. Для исследования отбирают 0,1мл эритроци­тов, трижды отмытых охлажденным изотоническим раствором.

Их гемолизируют внесением в пробирку 2,0 мл дистиллированной воды. К полученному гемолизату добавляют 1,0 мл раствора ТХУ и 1,0 мл раствора ТБК.

Пробу прогревают в кипящей водяной бане в течение 10 мин, затем центрифугируют 10 мин при 3000 об/мини и измеряют интенсивность окраски при длине волны 540 нм (желательно на спектрофотометре) в кювете с толщиной слоя 1 см.

Расчёт по формуле:

Аоп • 106 • 4 (мл)

С (мкмоль/л) = 1,56 • 105 • 0,1 (мл); ,

Где: 4 мл - объем водной фазы,

0,1 мл - объем эритроцитарной массы,

106 - коэффициент перевода «моль/л» в «мкмоль/л»,

1,56 • 105 - коэффициент молярной экстинкции.

Нормальные значения: 0,12 -0,23 мкмоль/л.