5.5. Визначення амілолітичної активності.

Амілази каталізують гідроліз високомолекулярних полісахаридів крохмалю і глікогену. Найважливішим джерелом амілаз є злакові, які містять їх як у непророщеному, так і (особливо багато) в пророщеному зерні. В останньому випадку амілази мають високу активність.

Широке застосування амілази знаходять у крохмало–патоковому, спиртовому, пивоварному і хлібопекарному виробництвах як головні ферменти, що каталізують процеси розщеплення крохмалю й утворення бродильного цукру.

Амілолітична активність характеризує здатність ферментів каталізувати гідроліз крохмалю до декстринів, які не забарвлюються йодом. Метод характеризує активність α-амілази, але при наявності в препараті β-амілази і глюкоамілази цим методом визначають сумарну дію всіх амілолітичних ферментів.

За одиницю амілолітичної активності прийнято таку кількість ферменту, яка каталізує розщеплення 1 г розчинного крохмалю до декстринів, які не забарвлюються йодом за 1 год при 30°С у чітко визначених умовах.

Амілолітичну здатність препарату (АЗ) виражають числом указаних одиниць в 1 г сухого препарату чи в 1 мл розчину. При такому способі вираження АЗ безпосередньо показує, скільки грамів крохмалю може бути прогідролізовано до нездатних забарвлюватися йодом декстринів 1 г препарату, культури чи 1 мл розчину за 1 год (в умовах, аналогічних умовам визначення).

Принцип методу грунтується на гідролізі 1,0%-го буферного розчину крохмалю. Кінець реакції контролюється візуально за йодною пробою. За часом, протягом якого проходить розщеплення крохмалю до продуктів, що не забарвлюються йодом, визначається амілолітична активність препарату,

Хід роботи. В конічну колбу на 50–100 мл вносять піпеткою 20 мл 1,0%-го розчину крохмалю і поміщають у термостат з температурою 30°С. Загальний об'єм реакційної суміші завжди повинен бути рівний 30 мл, і якщо на аналіз беруть менше 10 мл ферментного розчину, об’єм, кого нестає доповнюість дистильованою водою, яку приливають перед додаванням ферментного розчину.

Через 10 хв витримки в термостаті в колбу вносять ферментний розчин при ретельному перемішуванні і точно за секундоміром відмічають час.

За початок реакції приймають час, коли з піпетки виллється половина вмісту. Через кожну хвилину після початку реакції або частіше скляною паличкою відбирають краплину суміші і на білій порцеляновій пластинці з'єднують її з раніше нанесеною краплиною робочого розчину йоду.

Реакція розщеплення крохмалю вважається закінченою, коли йод перестане змінювати забарвлення на синє при з’єднанні з краплиною дослідної рідини (протягом перших 10 с).

Час, за який проходить розщеплення крохмалю до продуктів, що не забарвлюються йодом, може становити від 3 до 20 хв., але більш надійні результати отримують у межах від 5 до 15 хв. Всі піпетки, які використовуються при аналізі, повинні мати ватні тампони (для запобігання попадання слідів слини).

Примітка. Якщо час зникнення забарвлення менше 3 хв., то визначення повторюють з меншою кількістю розчину ферменту, наприклад – 2 мл. У цьому випадку в пробірку чи колбу з 20 мл крохмалю вносять 3 мл дистильованої води. Під час аналізу дуже активних препаратів концентрації розчинів роблять меншими (0,1г в 200 або 500 мл).

Якщо час зникнення забарвлення становить більше 20 хв., то готують розчин ферменту більшої концентрації, наприклад, 1:50 чи 1:100, а рідину можна нерозбавляти зовсім.

При часі зникнення забарвлення в межах 3–5 хв. проби відбирають кожні 15 с; 5–10 хв. – кожні 30 с; а більше 10 хв. – кожну хвилину.

Скляну паличку після кожної проби промивають дистильованою водою і витирають чистим некрохмаленим рушником.