2. 6. Проанализируйте преимущества биотехнологического производства витаминов на конкретных примерах и определите его основные недостатки.
Витамины - низкомолекулярные органические соединения, необходимые для жизнедеятельности организма, синтез которых в организме либо ограничен, либо отсутствует. Почти все водорастворимые витамины, а также жирорастворимый витамин К являются коферментами или кофакторами биохимических реакций. Витамины А, Q, Е регулируют генетический аппарат клетки.
В производстве витаминов ведущее место занимают химические методы, но в ряде производств в качестве их полноправного конкурента выступают биотехнологические методы, использование которых более предпочтительно в связи с ужесточением экологических требований к фармацевтическому производству. Биотехнологическое производство витаминов сложного химического строения - В12, В2, В3 и D (эргостерина) - осуществляется в одну стадию. Также микроорганизмы нашли свое применение и в синтезе витамина С.
Преимущества биотехнологического производства витаминов
1) возможность реакций, не осуществимых при химическом синтезе. Получение витаминов сложной структуры (B2, В12, предшественники витамина D)
2) относительно простое оборудование и отсутствие агрессивных реагентов (отличие от химического синтеза)
3) относительно дешевые исходные соединения
4) генетическая трансформация продуцентов позволяет получить высокие выходы витаминов
5) возможность сочетания биотехнологических методов с химическими синтезами, в результате чего сокращается число стадий химического синтеза витаминов (витамины D, C, убихиноны, каротиноиды.)
6) экономичность производства
7) отсутствие вредных выбросов
Недостатки биотехнологического производства витаминов
Для витаминов относительно простой структуры экономически более целесообразно использовать химические синтезы (А, В3)
В некоторых случаях микроорганизмы образуют токсичные метаболиты, а грибы – споры
Теоретически возможны мутации продуцента и появление патогенных свойств.
В качестве примера рассмотрим биотехнологическое производство витаминов В2, В12 и витамина С.
Рибофлавин (витамин в2)
Биологическая роль рибофлавина. Рибофлавин (витамин В2) – впервые выделен в 1933 г из яичного белка и молочной сыворотки. Содержится в продуктах растительного и животного происхождения: аспарагусе, попкорне, бананах, дрожжах, молочной сыворотке, мясе, рыбе, оболочках семян злаковых культур.
В организме человека рибофлавин подвергается фосфорилированию в положении 5 остатка рибитола: взаимодействует с АТФ, образует флавинмононуклеотид (ФМН) и флавин-аденин-динуклеотид (ФАД). ФАД и ФМН – коферменты флавинпротеинов, участвуют в переносе протонов и регулировании окислительно-восстановительных процессов, обмене аминокислот, липидов, углеводов. Поддерживают нормальную функцию глаза, участвуют в синтезе гемоглобина
Биосинтез флавинов осуществляется как растительными, так и многими бактериальными клетками, а также плесневыми грибами и дрожжами. Благодаря именно микробному биосинтезу рибофлавина в желудочно-кишечном тракте жвачные животные не нуждаются в этом витамине. У человека синтезирующихся флавинов не достаточно для предупреждения гиповитаминоза.
Описание. Рибофлавин представляет собой жёлто-оранжевого цвета игольчатые кристаллы, собранные в друзы, горького вкуса. В основе молекулы рибофлавина лежит гетероциклическое соединение изоаллоксазин, к которому в положении 9 присоединен пятиатомный спирт рибитол. Рациональное название: 7,8-диметил-10-(1D-рибитил)-изоаллоксазин.
Витамин В2 хорошо растворим в воде, устойчив в кислой среде, но легко разрушается в нейтральной и щелочной средах, а также под действием УФ-облучения.
Рис. 1. Химическая структура витамина В2.
Биотехнологическое производство рибофлавина
Продуценты. При промышленном получении рибофлавина используют культуры дрожжеподобных грибов Eremothecium ashbyii, Ashbya gossipii, Candida famata Candida flaveri, синтезирующих до 10 г/л рибофлавина соответственно. Серьезным недостатком этих культур является их нестабильность при хранении на твердых средах во всем диапазоне температур - от комнатной до температуры лиофилизации, в результате чего они теряют способность к сверхсинтезу рибофлавина.
Мутанты-сверхпродуценты рибофлавина получают путем выращивания штаммов на специальной культуральной среде с флавиновыми нуклеотидами, нарушающими ретроингибирование синтеза витамина В2. Отбор ведут по устойчивости к аналогу В2 розеофлавину. Посевной материал, споры гриба Eremothecium ashbyii, выращивают на твердом субстрате - пшене (7 - 8 дней при 29 - 30 °С). После стерилизации жидкий посевной материал подается в ферментер.
Питательная среда. В состав питательной среды для роста продуцентов витамина В2 входят соевая мука, кукурузный экстракт, сахароза, карбонат кальция, хлорид натрия, гидрофосфат калия, витамины, технический жир. Грибы весьма чувствительны к изменению состава среды и подвержены инфицированию. Перед подачей в ферментер среду подвергают стерилизации, добавляя к ней антибиотики и антисептики. Подготавливают жидкую питательную среду и посевной материал культуры дрожжей в разных емкостях - ферментере и посевном аппарате (инокуляторе).
Процесс ферментации грибов для получения кормового рибофлавина длится 3 суток при температуре 28 - 30 °С. По завершении ферментации культуральную жидкость концентрируют (упаривают в вакууме) и высушивают на распылительной сушке.
Немецкий химический концерн BASF построил в Южной коре завод, специализирующийся на производстве рибофлавина с использованием гриба Ashbya gossypii, его также называют Eremothecium gossypii. Концентрация рибофлавина в их промышленных штаммах столь высока, что мицелий гриба красно-коричневый. Рибофлавин накапливается в вакуолях, и его кристаллы иногда разрушают мицелий.
В настоящее время вместе с вышеуказанными культурами при промышленном получении рибофлавина используется мутантный штамм продуцент Васillus subtilis с нарушенной регуляцией синтеза витамина В2. Этот штамм устойчив к наиболее сильному антиметаболиту рибофлавина — его аминоаналогу розеофлавину и обладает способностью к сверхсинтезу витамина В2. При культивировании его на среде с мелассой и дрожжевым экстрактом в культуральной жидкости накапливается 3,5 — 4,5 г/л рибофлавина. При этом время ферментации сократилось в 3 раза.
Рибофлавин получают и химическим методом, используя в качестве биокатализатора сухие клетки бревибактерий. Причем, если биосинтез с нативными клетками занимает несколько суток, то при биосинтезе с суспензией сухих клеток время синтеза ФАД составляет всего 15—17 ч.