Rf для аминокислот при разделении методом хроматографии на бумаге
L-Аминокислота |
RF |
|
н-Бутанол – 12 Уксусная кислота – 3 Вода – 5 |
н-Бутанол – 1* пиридин – 1 вода – 1 |
|
Глицин |
0,23 |
0,29 |
Аланин |
0,30 |
0,37 |
Серин |
0,22 |
0,33 |
Цистеин |
0,08 |
0,14 |
Аспарагиновая к-та |
0,23 |
0,20 |
Аспарагин |
0,12 |
0,20 |
Фенилаланин |
0,60 |
0,63 |
Тирозин |
0,45 |
0,60 |
Триптофан |
0,50 |
0,62 |
Гистидин |
0,23 |
0,29 |
Валин |
0,51 |
0,48 |
Треонин |
0,26 |
0,36 |
Метионин |
0,50 |
0,53 |
Глутаминовая к-та |
0,28 |
0,20 |
Глутамин |
0,17 |
0,23 |
Лейцин |
0,70 |
0,60 |
Изолейцин |
0,67 |
0,56 |
Аргинин |
0,15 |
0,15 |
Лизин |
0,12 |
0,13 |
Пролин |
0,34 |
0,34 |
* Указаны объёмные части.
После проявления хроматограмм рассчитывают хроматографические константы RF (от англ. ratio of fronts – отношение фронтов, рис. 2.3). При четком выполнении рекомендованных условий они могут применяться для идентификации.
RF вещества А рассчитывают как отношение длины пробега от линии старта до центра пятна А к фронту растворителя, т.е. RFА = = А/F. Аналогично RF В = В/F (см. рис. 2.3). Полученные величины RF сравнивают с табличными. Однако такая идентификация весьма ненадежна, поскольку RF весьма вариабельна и зависит от многих факторов. Если исследуется препарат, в котором предполагается наличие определенных аминокислот, то на пластинку необходимо нанести свидетели, т.е. растворы предполагаемых веществ. Это увеличивает достоверность анализа.
Бумажная хроматография (БХ) широко применяется для анализа аминокислот и других полярных соединений: высших карбоновых кислот, высших спиртов, фенольных соединений и др. Носителем неподвижной фазы служит хроматографическая бумага – особый тип фильтровальной бумаги высокой чистоты и равномерной плотности. В зависимости от плотности бумага подразделяется на медленную, среднюю и быструю.
Неподвижной фазой, если бумага специально не обработана, является вода, находящаяся в порах целлюлозы (около 14-20% в воздушно-сухой целлюлозе). По технике выполнения нет принципиального отличия от ТСХ, если фронт растворителя движется снизу вверх (восходящая БХ). Однако лист бумаги не прислоняют к стенке камеры как пластинку, а всегда подвешивают в хроматографической камере вертикально. Для этого по диаметру стакана натягивают и приклеивают к наружным стенкам камеры тонкую нитку. Длина бумажной полоски равна расстоянию от дна стакана до верхнего края плюс еще 1 см. На бумаге делают сгиб и за этот сгиб подвешивают ее на нить так, чтобы ее нижний конец лишь касался дна, и закрывают крышку.
Опыт 13. Идентификация аминокислот методом ТСХ и БХ. На бумажную полоску наносят пятно исследуемого раствора аминокислоты, как описано выше, высушивают и хроматографируют в одной из систем, приведенных в табл. 2.1. Бумагу высушивают, смачивают 0,25%-ным раствором нингидрина в ацетоне и после испарения ацетона нагревают 5 мин в сушильном шкафу при 100ºС. Вычисляют RF и, сопоставляя его с данными табл. 2.1, делают заключение о подлинности препарата.