Федеральное агентство по образованию

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования

Вятский государственный университет

УДК

Инв. №

УТВЕРЖДАЮ

Проректор по научной работе

кандидат технических наук,

доцент В.С. Кожин

« » 2005 г.

ОТЧЕТ

О НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЕ

ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ НАКОПЛЕНИЯ НЕФТЕОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ В АКВАТОРИИ АЗОВСКОГО МОРЯ

(ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНЫЙ)

Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор

Е.В. Пименов

Нормоконтроль

доктор медицинских наук,

профессор

И.П. Погорельский

Киров 2005

СПИСОК ИСПОЛНИТЕЛЕЙ

Руководитель темы доктор медицинских наук, профессор		Е.В. Пименов (в полном объеме)
Заведующий кафедрой «Микробиологии», доктор медицинских наук, профессор		И.В. Дармов (в полном объеме)
Доктор медицинских наук, профессор		И.П. Погорельский (в полном объеме)
Кандидат биологических наук, доцент		К.Е. Гаврилов (в полном объеме)
Кандидат биологических наук, доцент		А.Г. Лазыкин (в полном объеме)
Аспирант		Н.С. Мокрушина (раздел 2, 3)

Реферат

Отчет 55 с., 7 табл., 54 источников

АЗОВСКОЕ МОРЕ, АКВАТОРИЯ, НЕФТЕОКИСЛЯЮЩИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ, ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ

Объектом исследования являются гетеротрофные и углеводородокисляющие микроорганизмы в различных по степени загрязненности участках акватории Азовского моря.

Цель работы – микробиологический мониторинг акватории Азовского моря с целью определения количества гетеротрофных микроорганизмов, в том числе нефтеокисляющих бактерий, являющихся маркерами загрязнения водных масс органическими веществами, нефтью и нефтепродуктами.

Использовались лабораторные микробиологические методы, а также статистической обработки экспериментальных данных.

Изучена динамика сезонных колебаний численности гетеротрофных и нефтеокисляющих микроорганизмов. Разработан способ оценки загрязнения по угнетению роста тест-культуры.

Целесообразно продолжить изучение углеводородоокисляющих микроорганизмов, исследовать их биохимические и генетические характеристики, оценить видовой состав, что позволит эффективнее оценивать и прогнозировать последствия влияния загрязнения на морскую экосистему.

Настоящий отчет составлен в соответствии с требованиями гост 7.32 -2001.

Содержание

Введение	8
Основная часть 1 Аналитический обзор и выбор направления исследований	10
1.1 Обоснование целесообразности изучения аутохтонной микрофлоры Черного и Азовского морей для оценки их экологического состояния	10
1.2 Нефтеокисляющие микроорганизмы как маркеры загрязнения морской экосистемы	15
1.3 Анализ существующих микробиологических показателей для оценки степени чистоты (загрязненности) морской воды	20
1.4 Выбор направления исследований	27
2 Теоретические и экспериментальные исследования	29
2.1 Материалы и методы	29
2.1.1 Штаммы микроорганизмов	29
2.1.2 Питательные среды и растворы	29
2.1.3 Реактивы	29
2.1.4 Методы исследований	29
2.1.5 Приборы и оборудование	30
2.1.6 Статистическая обработка экспериментальных данных	30
2.2 Оценка биоразнообразия морских микроорганизмов как основа изучения зависимости их изменений от антропогенной нагрузки	31
2.2.1 Изучение влияния условий транспортировки и хранения проб морской воды на жизнеспособность микроорганизмов	31
2.2.2 Изучение основных культурально-морфологических свойств микроорганизмов, выделенных из морской воды в разное время года	33
2.3 Изучение количественных показателей популяции микроорганизмов акватории Азовского моря 2.3.1. Фоновое состояние аэробной микрофлоры в различных точках акватории Азовского моря	37 37
2.3.2 Динамика численности нефтеокисляющих микроорганизмов	40
2.4 Разработка способа биотестирования степени загрязнения морской воды по угнетению роста тест-культуры	43
2.5 Обобщение и оценка результатов исследований	46
3 Заключение	48
4 Список использованных источников	49

Нормативные ссылки

В настоящем отчете о НИР использованы следующие стандарты:

ГОСТ 2.105-95 Единая система конструкторской документации. Общие требования к текстовым документам

ГОСТ 2.111-68 Единая система конструкторской документации. Нормоконтроль

ГОСТ 6.38-90 Унифицированные системы документации. Система организационно-распорядительной документации. Требования к оформлению документов

ГОСТ 7.1.-84 Система стандартов по информации, библиотечному и издательскому делу. Библиографическое описание документа. Общие требования и правила составления

ГОСТ 7.9 – 95 (ИСО-214-76) Система стандартов по информации, библиотечному и издательскому делу. Реферат и аннотация. Общие требования

ГОСТ 7.12-93 Система стандартов по информации, библиотечному и издательскому делу. Библиографическая запись. Сокращения слов на русском языке. Общие требования и правила

ГОСТ 7.32-2001 Система стандартов по информации, библиотечному и издательскому делу. Отчет о научно-исследовательской работе. Структура и правила оформления

ГОСТ 7.54-88 Система стандартов по информации, библиотечному и издательскому делу. Представление численных данных о свойствах веществ и материалов в научно-технических документах. Общие требования

ГОСТ 8.417-81 Государственная система обеспечения единства измерений. Единицы физических величин

ГОСТ 9327-60 Бумага и издания из бумаги. Потребительские форматы

Определения, обозначения и сокращения

Автотрофные организмы - организмы, синтезирующие из неорганических веществ необходимые для жизни органические вещества.

Аутохтонная микрофлора – совокупность микроорганизмов, постоянно живущих и размножающихся в воде.

Биоценозы – исторически сложившиеся группировки живых организмов биосферы, заселяющие общие места обитания, возникшие на основе биогенного круговорота и обеспечивающие его в конкретных природных условиях.

Гетеротрофные бактерии – бактерии, использующие в качестве источника энергии и углерода органические, т. е. углеродсодержащие соединения.

Олиготрофность – незначительное содержание питательных веществ.

Психрофильные микроорганизмы - микроорганизм, способные расти при низких температурах (от + 5 до -6 С).

Фототрофные микроорганизмы - микроорганизмы, использующие в качестве энергии для жизнедеятельности свет (лучистую энергию); в процессе фотосинтеза ассимилируют углекислоту и другие неорганические, а также органические соединения.

БОЕ – бляшкообразующая единица

ГОСТ – государственный стандарт

ж. м. к. – живые микробные клетки

ИСО – Международная организация по стандартизации

КОЕ – колониеобразующие единицы

ЛД₅₀ – летальная доза, вызывающая гибель 50% зараженных организмов

м.к. – микробные клетки

ОК - оптическая концентрация, микр. · см^-3

ПДК – предельно-допустимая концентрация

ППС - плотная питательная среда

ПС – питательная среда

РНК – рибонуклеиновая кислота

I₉₅ - доверительный интервал средних величин для уровня вероятности 0,95

X - средняя величина

Введение

В настоящее время проблема защиты окружающей среды от антропогенного воздействия входит в число приоритетных в связи с резким ухудшением среды обитания и крайне медленным естественным ее восстановлением. С развитием и интенсификацией хозяйственной и промышленной деятельности человека объем вредного воздействия человека на природу стал превышать ее восстановительный потенциал.

Среди множества загрязнений окружающей среды нефть и нефтепродукты можно выделить в отдельную группу веществ, оказывающих влияние на состояние водных экосистем.

Азовское море в последнее время является зоной активной деятельности человека. На его берегах располагаются агропромышленные комплексы и целый ряд населенных пунктов. В шельфе Азовского моря ведется добыча нефти, кроме того, акватория моря активно используется в качестве транспортной магистрали. Все это создает предпосылки для попадания в море нефти и нефтепродуктов.

Известно, что микроорганизмы обладают способностью к деструкции нефтяных загрязнений и введению их в естественный круговорот углерода. Присутствие нефтяных углеводородов в водной экосистеме неизбежно приводит к изменениям в структуре естественных микробиоценозов.

Нефтеокисляющие микроорганизмы водных экосистем, как незагрязненных, так и содержащих разные количества нефтяных углеводородов, были объектом исследования в ряде работ [1,2]. Однако все они содержат сведения об уже сложившихся углеводородокисляющих бактериоценозах, динамика же формирования последних до сих пор остается практически неизученной.

В этой связи исследования динамики накопления нефтеокисляющих микроорганизмов в акватории Азовского моря являются актуальными.

Целью настоящей работы является микробиологический мониторинг акватории Азовского моря с целью индикации гетеротрофных сапрофитных микроорганизмов, в том числе нефтеокисляющих бактерий, являющихся маркерами загрязнения водных масс органическими веществами, нефтью и нефтепродуктами.

Для достижения поставленной цели представлялось необходимым провести анализ данных научной литературы по вопросам использования стандартизованных микробиологических методов оценки степени чистоты (загрязненности) морской воды; изучить сезонные колебания общей численности бактерий, количество сапрофитных гетеротрофных бактерий, в том числе нефтеокисляющих.

Работа реализована составлением проекта технического задания на новую НИР «Разработка методов биотехнологической очистки природных объектов при бурении».

Основная часть

1. Аналитический обзор и выбор направления исследований

1.1. Обоснование целесообразности изучения аутохтонной микрофлоры Черного и Азовского морей для оценки их экологического состояния

За последние десятилетия в ходе развития технической революции и становления техногенной цивилизации воздействие человека на окружающую среду многократно возросло. В настоящее время складывается сложная экологическая ситуация в связи с загрязнением Черного и Азовского морей. Высокая концентрация промышленных предприятий, сельскохозяйственного производства, расположенных на побережье обоих морей, особенно на территории Ростовской области, а также пренебрежение природоохранными и ресурсосберегающими технологиями постепенно разрушают природное равновесие экосистемы. Ежегодно происходит 20-30 случаев разливов нефти в бассейнах обоих морей в результате аварий при добыче, транспортировке, хранении и переработке, что значительно превышает воспроизводительную способность морской экосистемы к восстановлению [3]. В то же время повышение цен на нефть на Мировом рынке неизбежно привлечет в этот регион нефтедобывающие компании, что приведет к еще большему увеличению антропогенной нагрузки на экосистему. Кроме прямых экологических ущербов природной среде и сокращения рыбных ресурсов, Россия ежегодно теряет десятки миллионов долларов в результате, как загрязнения экосистем вышеназванных морей, так и в результате потери привлекательности края для отдыха, лечения и туризма.

Известно, что нефть и различные углеводороды, близкие к нефтяным, всегда присутствовали в морской воде, которые попадали в море из естественных природных источников. Ежегодно в Мировом океане фиксируется в процессе фотосинтеза 43 Гт органического углерода. Но это количество не наносит вреда морской среде [4, 7].

В море в процессе эволюции выработался механизм естественного самоочищения, протекающего под действием физических, химических и биологических факторов. Ведущая роль в деструкции органических веществ, попадающих в окружающую среду, принадлежит микроорганизмам, в том числе нефтеокисляющим [4, 5, 6].

В морской воде углеводородокисляющая микрофлора в основном представлена следующими родами: бактерий Rhodococcus, Corynebacterium, Nocardia, Arthrobacter, Acinetobacter, Cytophaga, Clostridium, Micrococcus, Corynebacterium, Flavobacterium, Methanobacterium, Mycobacterium, Pseudomonas, Vibrio; дрожжей Candida, Endomyces, Rhodotorula, Saccharоmyces, Torulopsis; грибов Penicillinum, Trichoderma, Aspergillus, Mucor, Fusarium [7, 8].

Своеобразие жизни моря связано со свойствами сре­ды обитания, характеризующейся определенными физико-химиче­скими параметрами, влияющими на рост, размножение и видовой состав бактерий в водной среде [9].

Прежде всего, море можно рассмотреть как вод­ный раствор электролитов средней концентрации, содержащий в основном NaCl и MgS0₄ с небольшими примесями и следами почти всех элементов. Структура жидкой воды изменяется под влиянием растворенного вещества. В поверхностном слое соленость воды может колебаться от 1,8 (в условиях сильного опреснения, например при таянии льдов) до 2,2 (в условиях сильного испарения воды при жарком климате) [10].

Следую­щим фактором морской среды обитания явля­ется гидростатическое давление, которое увеличивается на 1 атмосферу с понижением глубины на каждые десять метров [5,6].

В зависимости от содержания растворенного кислорода, всю водную массу подразделяют на ряд экологических зон: аэробную, микроаэрофильную и анаэробную. В каждой зоне обитают бактерии разных таксономических групп, выполняющие разные экологические функции [9]. В настоящее время принято мнение, что аборигенами моря являются психрофильные бактерии [11].

Температура среды обитания является существенным фактором, влияю­щим на жизнедеятельность микроорганизмов в морской среде. В верхнем слое воды температура может колебаться от минус 2 °С до плюс 32 °С. Показано, что от 25 до 37 % изолятов из мор­ской воды не может расти уже при 15°С, а для 62 % микробов летальна температура 20 °С [11, 12].

Не менее важным фактором, необходимым для фотосинтезирующих микроорганизмов, является свет. Глу­бина проникновения солнечного света в водную массу в основ­ном зависит от степени прозрачности воды. Предельной границей эуфотической зоны, в ко­торой возможен активный оксигенный фотосинтез, принято счи­тать 30 м. Лучи солнечного спектра поглощаются водой с разной интенсивностью. Оптимальная интенсивность света для развития и фотосинтеза фитопланктона соответствует длинам волны 450 и 680 нм в пределах освещенности 3000—10000 лк. Максимальное поглощение характерно для ультрафиолетовых и красных лучей, глубже всего проникают в воду зеленые и голубые лучи длиной волны 500 — 560 нм, поэтому на больших глубинах получают пре­имущества цианобактерии и зеленые бактерии, обогащенные ка-ротиноидами или фикоэритрином. Если свет достигает поверхности донных осадков, на них происходит развитие макрофитов и (или) фототрофных микробных сообществ с преобладанием циа­нобактерий — цианобактериальных матов [7].

Помимо рассмотренных характеристик, большое значение для сущест­вования микроорганизмов в морской воде имеет содержание органического ве­щества [1]. Так, в эуфотической зоне оно составляет 0,5—3,0 мг/л. Основная масса глубинных вод олиготрофна и содержит около 0,5—1,5 мг/л углерода органических соединений [10]. До 80% взвешенного органического вещества разлагается в водной массе в аэробных условиях, не достигая дна, - до глубины 10 м. Ввиду олиготрофности морских вод размножение морской микрофлоры приурочено к местам развития водорослей и животных [13]. Так, лизис живых клеток цианобактерий и зеленых водорослей осуществляется миксобактериями, флексибактериями, вибрио­нами (Cellvibrio). Миксобактерии и спороцитофаги разлагают клетчатку, крахмал, альгиновую кислоту, глюкозиды. Хитин раз­рушают представители родов Lysobacter и Beneckea, агар - Alginomonas, Vibrio, Agrobacterium, Cytophaga, Sporocytophaga [11].

Указанную выше приуроченность микробов к источникам питания можно представить следующим образом:

1. Микроорганизмы, связанные с жизнедеятельностью других микро­организмов.

2. Микроорганизмы, приуроченные к ареалам расселения животных.

3. Микроорганизмы, использующие органические вещества водорослей прибрежных и открытых районов.

4. Микроорганизмы, связанные с частицами детрита, которые могут служить плацдармом для ряда форм бактерий, имеющих сложный цикл развития, таких, как почкующиеся бактерии [12].

Однако, учитывая возрастающую хозяйственную деятельность человека, мы считаем целесообразным включение в эту классификацию и еще пункта о приуроченности микроорганизмов к местам антропогенной деятельности.

Таким образом, морская экосистема представляют собой чрезвычайно сложную динамическую систему, открывающую возможность для развития разнообразных видов микроорганизмов, которые обеспечивают цикличность круговорота всех главных биогеохимических элементов и осуществляют энергетическую взаимосвязь процессов, происходящих в разных ее экологических зонах.

За последние 40 лет практи­ческого применения концепции видового разнообразия накопились данные о том, что биотическое разнообразие не мо­жет служить параметром для ранней ди­агностики «патологических» изменений в состоянии сообществ, однако при загрязнении среды обитания число видов действительно может уменьшиться. В то же время, все больше накапливается конкретных примеров, когда в заведомо загряз­ненных экосистемах разнообразие обитающих там видов не мень­ше, а иногда и больше, чем оно было ранее в отсутствие загряз­нения. Это особенно характерно для тех мест, где загрязнения носят хронический характер [7]. В этом случае кардинально изменя­ется весь видовой состав сообщества, когда на место видов, чув­ствительных к данным загрязнениям, приходят другие, более вы­носливые виды, либо существовавшие раньше в том же сообще­стве, но в незначительном количестве, либо вообще вселившиеся извне благодаря устранению конкурентов. Это можно наблюдать при разливе нефти - как наиболее часто встречающегося и тяжелого по своим последствиям фактора загрязнения морской экосистемы [7].

Нефть может способствовать селекции видов микроорганизмов способных к использованию углеводородного сырья в качестве компонента пищи, поэтому их количество и активность может увеличиваться многократно [6, 7].

Нефть существует в морской воде в виде пленки. Известно, что лишь 15-17% нефтепродуктов остаются в пленочной фазе, около 50% испаряются в виде легких фракций, 23-28 % составляют нефтяные агрегаты, 1-5 % растворяются в воде [14,15]. Физические параметры (толщина, плотность, цвет, площадь распространения по поверхности воды) нефтяной пленки зависят от факторов окружающей среды. Так, при высокой температуре пленка растекается, толщина ее уменьшается от 0,05 мм до 1,0210^-3 мм, окраска светлеет, при охлаждении площадь уменьшается, толщина и плотность пленки возрастают, она становится коричневой или черной [4]. Разлитая нефть разносится ветром и течением на большие расстояния, одновременно проникая в более глубокие слои водной толщи [14-18]. К тому же нефтяные пятна «закупоривают» воду, тем самым нарушают естественную циркуляцию кислорода между водной и воздушной средами [19].

Таким образом, сложная экологическая обстановка в регионах Черного и Азовского морей способствует нарушению природного равновесия в морских экосистемах, приводит к кардинальному изменению в них видового спектра микроорганизмов, что оказывает значительное влияние на жизнедеятельность других обитателей морей. Поэтому изучение аутохтонной микрофлоры морской среды с целью оценки экологического состояния Черного и Азовского морей является важной практической задачей.