Глава 2.Дезоксирибонуклеиновые кислоты.
СОСТАВ И СТРУКТУРА ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ.
Молекулы ДНК, выделенные из ядер клеток, в электронном микроскопе представлены в виде длинных нитей, состоящих из большого числа дезоксирибонуклеотидов. Нити ДНК толще и длиннее, чем нити белков. Длина молекулы ДНК достигает сотен тысяч нанометров. Это несравнимо больше самой крупной белковой молекулы, которая в развернутом виде достигает в длину не более 1ОО—200 нм. Молекула ДНК по массе достигает 6*1О-12 грамма.
Генетическая информация, заключенная в ДНК, состоит из последовательности нуклеотидов. ДНК состоит в основном из четырех нуклеотидов, которые соответствуют четырем азотистым основаниям: аденину, гуанину, тимину и цитозину. Кроме этих оснований, препараты ДНК могут содержать метилированные производные этих оснований.
Основную структурную цепь молекулы ДНК образуют последовательно соединенные друг с другом молекулы пентозы и ортофосфорной кислоты. Цепь ДНК представляет углеводно-фосфатную последовательность, с которой соединены азотистые основания. Углеводные и фосфатные группы выполняют только структурную функцию. Молекулы ортофосфорной кислоты соединяют между собой молекулы дезоксирибозы за счет образования химических связей. При взаимодействии гидроксильной группы 3-го атома углерода одной молекулы пентозы с гидроксильной группой 5-го углеродного атома другой молекулы пентозы отщепляется молекула воды. Тогда у остатков ортофосфорной кислоты сохраняется еще по одной гидроксильной группе, способной диссоциировать. Это обусловливает кислотные свойства всей макромолекулы ДНК.
Молекула ДНК имеет две цепи нуклеотидов, расположенных параллельно друг другу, но в обратной последовательности. Эти цепи удерживаются между собой за счет водородных связей между парами аденин - тимин и гуанин - цитозин. При этом азотистые основания располагаются внутри спирали. Водородные связи образуются между любым электроотрицательным атомом, например кислородом тимина или азотом аденина и атомом водорода, ковалентно связанным с другим электроотрицательным атомом:
Между аденином и тимином образуются две водородные связи, между гуанином и цитозином — три. Эти связи играют очень важную роль в поддержании вторичной структуры ДНК.
Дополнение аденина тимином и гуанина цитозином, иначе называемое комплементарностью, обеспечивает одинаковое по всей длине двойной спирали расстояние между цепями и образование между противоположными основаниями максимального числа водородных связей, что придает молекуле одновременно устойчивость и подвижность. Последовательность оснований в одной цепи ДНК строго соответствует последовательности оснований в другой цепи. Это является необходимым условием функционирования ДНК и передачи наследственной информации. При необходимости двойная спираль ДНК легко рвется под действием фермента дезоксирибонуклеазы.
Молекула ДНК в ядре клетки не существует изолированно сама по себе. Она окружена связанными с ней белками. Но белки не принимают участия в передаче наследственной информации.
Основными белками, локализованными в ядре клеток и связанными с ДНК, являются специальные белки, называемые гистонами. Гистоны обладают основными (щелочными) свойствами благодаря высокому содержанию в них основных аминокислот. По-видимому, их действие компенсирует в некоторой степени кислотные свойства нуклеиновых кислот. По преобладающему содержанию аминокислот выделяют пять важнейших гистонов: гистон Н1 имеет высокое содержание лизина, гистон Н2b лизина содержит меньше, чем предшествующий гистон, гистон Н2а имеет высокое содержание лизина и аргинина, гистон Н3 содержит большое количество аргинина, гистон Н4 богат аргинином и глицином.
Помимо ядерной ДНК, эукариотические клетки содержат небольшое количество цитоплазматической ДНК, т. е. ДНК, которая располагается в цитоплазме, за пределами ядра. Эта ДНК называется внеядерной. На долю внеядерной ДНК приходится около 0,1- 0,2 всей клеточной ДНК. Внеядерная ДНК отличается от ядерной составом азотистых оснований и молекулярной массой. Она находится в митохондриях - постоянно присутствующих внутриклеточных органоидах, участвующих в преобразовании энергии в клетке.
Небольшое количество ДНК содержат некоторые пластиды растительных клеток, в частности хлоропласты, — пластиды, имеющие хлорофилл и участвующие в процессе фотосинтеза.
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ
При нагревании ДНК денатурирует, т. е. разрушается. Денатурация двух цепочек ДНК происходит при температуре выше 90 0С, а инактивация (частичное разрушение) начинается про температуре 85 0С.
При нагревании раствора ДНК и одновременном регистрировании оптической плотности раствора при длине волны 260 нм при определенной температуре произойдет резкое увеличение поглощения света раствором. Наблюдается так называемый гиперхромный эффект. Температура, при которой наблюдается гиперхромный эффект, называется температурой плавления. Гиперхромный эффект при температуре плавления связан с тем, что происходит разрыв водородных связей и нарушается упорядоченность молекулы ДНК. Понятие температуры плавления в отношении ДНК связывают с кристаллическим состоянием молекулы ДНК до соответствующей температуры и нарушением упорядоченной структуры при нагревании выше температуры плавления. Характер дифракции рентгеновских лучей также указывает на кристаллическое строение дезоксирибонуклеиновой кислоты.
ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ГЕНЕ
Ген — это элементарная единица наследственности, представляющая собой определенную специфическую последовательность нуклеотидов в ДНК.
В хромосомах диплоидных организмов гены расположены парами. Хромосома разделена на участки - локусы. Локус — это место расположения того или иного гена в хромосоме. Сам ген состоит из двух или нескольких аллелей. Аллель - это один или несколько вариантов гена, которые могут находиться в данном локусе хромосомы. Таким образом, аллель представляет собой состояние гена, определяющее развитие данного признака.
Общее число генов в клетке высших организмов составляет около 100 000. Каждому гену соответствует свой белок. Структурные гены в геноме расположены в такой последовательности, в какой действуют образующиеся под их контролем ферменты. Структурными гены называются так потому, что они определяют структуру ферментов. Например, синтез аргинина происходит в четыре этапа, каждый из которых контролируется определенным ферментом. Вся последовательность ферментов закодирована в ДНК в виде генов в той же последовательности.
В генах закодирована генетическая информация, единицей которой является кодон — группа из трех по последовательных нуклеотидов, иначе называемая триплетом.
Многие гены, по крайней мере у прокариот, входят в состав оперона. Оперон – это группа генов, определяющая синтез функционально связанных ферментов. В него входят структурные и другие гены, например, ген - регулятор, который с небольшой, но постоянной скоростью обеспечивает синтез специфического белка, называемого репрессором. Этот белок обладает сильным сродством к гену—оператору и может легко присоединяться к нему. Ген - оператор управляет функционированием структурных генов. Он как бы то включает их, то выключает. При связывании гена—оператора с белком-репрессором работа структурных генов прекращается.
Долгое время считалось, что генетический аппарат клетки неподвижен, фиксирован и все гены занимают в нем строго определенное положение. Однако ряд данных не согласовывался с этим положением. Еще в конце 40-х годов Б. Макклинток (США) получила на кукурузе ряд мутаций, которые она объяснила наличием генетических элементов, меняющих свое место в ДНК. Это положение было настолько революционным, что к нему отнеслись вначале с большим недоверием. Тем более что полученные автором экспериментальные данные были только косвенным. Позднее подвижные гены были обнаружены у бактерий.
Сейчас считается, что и в клетках животных не все гены строго фиксированы — среди них также существуют подвижные гены, которые играют важную роль в эволюционном процессе. С подвижными генами, возможно, связано и возникновение злокачественных опухолей.
Ген важен еще тем, что он ответственен за проявление действия мутаций. Мутация - это внезапно возникшее изменение генетической информации, обусловленное изменением структуры кодирующей ее молекулы ДНК. Мутации, в зависимости от точки приложения, могут изменить внешние признаки организма, его физические особенности, биохимические и биофизические процессы, нарушить развитие, ослабить жизнеспособность организма или даже привести его к гибели. Чаще всего мутации сопровождаются неблагоприятными последствиями. Генные мутации являются причиной развития некоторых болезней, например серповидноклеточной анемии.
Явление мутации лежит в основе эволюции и селекции живых организмов. В результате репликации ДНК наследственные признаки передаются потомству, но только мутации обеспечивают возникновение какого-либо нового признака. И уже затем этот новый признак передается по наследству.
Для изучения мутаций и их последствий в отношении организма используют вещества, которые искусственно вызывают мутации. Вещества, вызывающие мутации, называются мутагенами. К таким веществам относятся, например, соединения из группы акридинов. Акридины состоят из трех расположенных рядом углеводородных колец, что определяет их окрашивающие и мутирующие свойства. В частности, к акридинам относится вещество акрифлавин.
Существуют и благоприятные мутации. Такие мутации приводят к тому, что замена, например, одной аминокислоты на другую сопровождается улучшением функционирования данного фермента. Такая мутация закрепляется в организме при последующем размножении вида.
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД
Генетический код — это система расположения нуклеотидов в нити ДНК, обусловливающая соответствующую последовательность расположения аминокислот в белке. Генетический код передается по наследству и определяет свойства организмов. Он может меняться в результате мутаций, которые бывают положительными и меняют его в сторону, благоприятную для организма, или, что бывает чаще, в неблагоприятную или даже губительную для конкретного организма.
Работы по расшифровке генетического кода проводились в основном на клетках бактерии кишечной палочки и были повторены на других видах бактерий, а также на организмах животных, включая человека, на растениях.
О коде заговорили всего девятнадцать лет назад; в 1951 году это слово впервые появилось в лексиконе биологов. Правда, произнес его не биолог, а физик.
Но сама идея о том, что в наследственном веществе записаны предписания, каким должен быть будущий организм,— эта идея в самой общей форме высказывалась, как это ни удивительно, много раньше. Сегодняшние историки генетики с изумлением обнаружили первое упоминание о возможности получить огромное многообразие наследственных признаков различным пространственным расположением атомов в макромолекулах еще в письмах Мишера — открывателя нуклеиновых кислот. Это конец ХIХ века. В начале нашего века, в 1927 году Николай Константинович Кольцов, представлял механизм передачи генетических свойств, вплотную подошел к идее кода. Наконец, в 1947 году выдающийся немецкий ученый Э. Шредингер, осмысляя жизнь с позиции физики, прямо назвал “структуру хромосомных нитей шифровальным кодом “.
Но, вероятно, биология еще не была достаточно подготовлена, чтобы принять новую, революционную идею. Хотя, казалось бы, все необходимые для этого знания уже были накоплены к 50-м годам.
Тот факт, что ДНК построена из нуклеотидов четырех сортов, а белок — из аминокислот примерно двадцати сортов и что ДНК каким-то образом направляет синтез белка, был известен биологам. И эти обстоятельства можно было объединить, усмотрев здесь причинную связь; однако сделано этого не было. В 1953 году Д. Уотсон и Ф. Крик открывают строение ДНК. Их модель вроде бы не накладывает никаких ограничений на последовательность нуклеотидов в одной цепи, но открыта строгая комплементарность оснований, и это может насторожить; можно увидеть здесь некий намек на возможность переноса закодированной информации, но... намек остается непонятым. Честно говоря, это одна из самых странных страниц в истории молекулярной генетики: как умудрились Уотсон и Крик пройти мимо генетического кода? Они сделали все, что бы максимально приблизить его открытие: они впервые установили структуру ДНК и механизм ее воспроизведения, то есть показали, каким образом информация, если предположить ее существование клетке, может передаваться из поколения в поколение; они впервые формулировали, пользуясь словами Ф. Крика, “одно из самых поразительных обобщений биохимии, которое (как это ни удивительно) едва ли даже упоминается в биохимических книгах,— то, что 20 аминокислот и 4 основания за немногим исключением одинаковы для всей природы. Они стояли так близко к идее кода, что кажется просто непонятным, как они не произнесли это магическое слово, которое, когда его произнесли, вызвало лавинный поток новых идей и работ и совершенно преобразило молекулярную биологию, сразу приблизив ее к таким наукам, как кибернетика и математика.
Вместо этого Д. Уотсон занялся поисками структурно-пространственного соответствия между нуклеиновыми кислотами и аминокислотами; эти поиски в то время ни к чему не привели.
По всей вероятности, как раз в этот период американскому физику и астроному Г. Гамову и приходит в голову идея кода. Во всяком случае из Нобелевского доклада Ф. Крика мы узнаем, что летом 1953 года они с Уотсоном послали Гамову письмо, в котором, отвечая на его просьбу, сообщали список 20 аминокислот. Гамову очень нужна была эта цифра, она сыграла в его логических построениях важнейшую роль. Любопытно, что фигурирующие сейчас во всех работах и книгах 20 магических аминокислот были впервые составлены именно в этом письме.
И вот в 1954 году на суд биологов выносится гипотеза чисто умозрительная, которую, несомненно, можно назвать одной из самых революционных гипотез в биологии.
Она гласит: информация, необходимая для синтеза белка, за кодирована в генах. Порядок чередования 20 аминокислот в белке записан в молекуле ДНК кодом — чередованием четырех нуклеотидов, или, что одно и то же, четырех азотистых основаниях.
Из четырех оснований можно получить следующее количество групп триплетов: 4 группы из букв одного сорта, 12 групп из букв двух сортов ,4 группы из букв трех сортов. Если предположить, как это сделал Гамов, что каждая группа, объединяющая тройки одинакового состава, но с разным порядком букв внутри тройки, кодирует одну аминокислоту, то тогда получается магическое число групп триплетов – 20. Все сходится
Так выглядел впервые предложенный код наследственности. Он был выведен теоретически на основании отвлеченных соображений, причем скорее математических, чем биологических. И эта отвлеченность тут же дала себя знать. Уже через очень короткое время было показано, что такой код не верен. Две посылки из трех, которые выдвинул Гамов, не выдержали дальнейшей проверки. И все же код Гамова сделал свое дело. Не важно, что он оказался на две трети неверным, ему можно простить все за то, что он был первым.
Следующий довод против перекрывания триплетов был получен при изучении мутаций гемоглобина. Из перекрывания следовало, что каждое основание учавствует в кодировании трех соседних аминокислот; а из этого соображения неумолимо следовал вывод, что в случае мутации, затрагивающей даже только один нуклеотид в гене, в молекуле белка обязательно произойдет изменение трех соседних аминокислот. Однако были обнаружены нарушения гемоглобина человека, затрагивающие только одну-единственную аминокислоту.
Наконец, удалось получить и непосредственное экспериментальное доказательство невозможности перекрывания.
Это было сделано в работах двух ученых – Френкель - Конрата из Беркли и Г. Виттмана из Тюбингена. Они работали с вирусом табачной мозаики (ВТМ) - объектом, хорошо изученным именно в этих лабораториях. О ВТМ было известно, что он состоит из РНК, имеющей около 6500 нуклеотидов, и белковой оболочки, состоящей из 2130 молекул. Каждая из молекул состоит из 158 аминокислотных остатков. Их порядок был точно установлен. В 1958 году Г. Шустер и Г. Шрам из Тюбингена обнаружили любопытный факт. Если на РНК ВТМ подействовать азотистой кислотой, может произойти изменение некоторых нуклеотидов. В этом году в этой же лаборатории А. Гирер и К. Мандри установили, что для мутации достаточно изменения только одного нуклеотида из 6500.
На основании этих исследований и была построена работа Г. Виттмана и Г. Френкель – Конрата. Они брали ВТМ, выделяли его РНК и обрабатывали ее азотистой кислотой – так, чтобы изменилось только одно основание. А потом заражали такой РНК растение и исследовали белок, образовавшийся в результате инфекции вируса. И что же? Из 158 аминокислот поврежденной оказывалась всегда только одна.
Так окончательно была похоронена возможность существования перекрывающегося кода.
Но тогда – какой он?
В 1957 году остроумную гипотезу выдвигают Ф. Крик, Д. Гриффит и Л. Оргель. Ф. Крик, разумеется, не мог остаться в стороне от того бурного водоворота идей, который закружился вокруг генетического кода. Быть может, поначалу и казалось, что можно обойтись общими соображениями, и поэтому в штурме кода приняли активное участие многие математики и физики. Однако быстро выяснилось, что наскоком твердыню не возьмешь. Нужна планомерная экспериментальная осада. И вот тут, на стыке теории и эксперимента, Ф. Крик смог в полной мере проявить свои выдающиеся способности.
“Основная польза теории,- писал Крик по поводу кода,- состоит в предложении новых форм доказательств и в оттачивании критического анализа. В конечном счете, решающее значение имеет качество экспериментальной работы”.
В 1957 году Ф. Крик споткнулся на том же месте, что к Гамов в 1954-м,— на магической двадцатке аминокислот. Правда, одну ошибку Гамова Крик учел: его код был неперекрывающимся и триплетным, но по-прежнему невырожденным. И поэтому все усилия Крика и его сотрудников были направлены на то, чтобы показать, каким образом из 64 слов только 20 могут кодировать аминокислоты.
Когда Крик убедился в банкротстве своей, казавшейся такой изящной, гипотезы, он не опустил руки и не стал, закрыв глаза на новые данные, доказывать свою правоту — он начал все сначала. И через некоторое время предложил новый код — триплетный, неперекрывающийся, вырожденный, без запятых, с началом отсчета в определенной точке и далее — по три основания.
Но недостаточно предложить новый код, надо предложить план эксперимента, в котором можно доказать правильность предположений.
Такой план был предложен и осуществлен Ф. Криком, Л. Барнет, С. Бреннером и Р. Уотс-Тобином в Кембритдже.
Все свои опыты они провели на одном определенном гене. Этот ген принадлежит молекуле ДНК фага Т-4, который инфицирует кишечную палочку. Через 20 минут после начала инфекции фаг образует внутри кишечной палочки около 100 своих копий. Бактерия гибнет, а фаги выходят наружу. Преимущество такого опытного материала очевидно: за короткое время можно получить миллиарды фаговых частиц — многие поколения, и на этих поколениях наблюдать мутации.
Мутации вызывались действием на фаг химического вещества – профлавина. Ученые доказали, что под влиянием профлавина происходит добавление или выпадение, по всей вероятности, одного из оснований.
Основной операцией в опыте было генетическое скрещивание. Бактериальную клетку заражали сразу двумя мутантными фагами. Примерно через 20 минут на месте клетки обнаруживалось около сотни новых фаговых частиц. Некоторые из них были сходны с одним родителем, некоторые – с другим, некоторые несли на себе признаки сразу обоих родителей, а некоторые вообще не имели никаких изменений – были похожи на немутировавшие фаги.