3.3.3. Методы фиксации и окраски препаратов

Фиксация мазков. Принцип.

Обработка мазков фиксирующими жидкостями, придающими форменным элементам стойкость по отношению к содержащейся в красках воде, которая без фиксации мазков гемолизирует эритроциты и изменяет строение лейкоцитов. Кроме того, фиксация, вызывая коагуляцию белка, прикрепляет препарат к стеклу.

Реактивы.

Химически чистый метиловый спирт (метанол) лучше всего; 96° этиловый спирт, денатурированный спирт, смесь Никифорова (смесь этанола 96% и наркозного эфира 1:1), жидкость Карнуа (этанол 96% - 60 %, хлороформа 30 %, ледяной уксусной кислоты 10 %), спирт-формол (40% формалин 5 мл, этиловый спирт 96° - 95 мл).

Методика.

Высохшие на воздухе мазки крови, сложенные попарно (мазками наружу), опускают пинцетом в специальную посуду для фиксации (в широкогорлую банку с притертой пробкой) или в обыкновенные стеклянные стаканы, обрезанные до 6—6,5 см и наполненные до определенной высоты фиксирующей жидкостью.

В метиловом спирте мазки выдерживают не менее 5 мин, а в этиловом и денатурированном спирте и смеси Никифорова — не менее 30 мин.

По окончании срока фиксации препараты вынимают пинцетом, сушат на воздухе или ополаскивают в банке с дист. водой и укладывают мазками кверху на стеклянный мостик для окраски.

Фиксации мазков парами фенола (по Сюткину). Принцип. Получение хорошего качества фиксации мазкой при отсутствии спирта.

Методика. В эксикаторе заменяют фарфоровую подставку на стеклянный мостик для мазков. На дно эксикатора наливают жидкость - фенол (90 весовых частей кристаллического фенола и 10 весовых частей дист.воды) из расчета 100 мл на 1,4 л объема эксикатора. В близи эксикатора на стене вешают термометр. Приготовленные обычным способом сухие мазки крови помешают в эксикатор на мостике в один ряд намазанной поверхностью вниз.

Для сохранения формы эритроцитов, лейкоцитов и дифференцированной окраски зернистости лейкоцитов воздействие на мазки крови паров фенола должно продолжаться в зависимости от комнатной температуры строго определенное время: при температуре 16—18° — 20 мин, при 19—21°— 10 мин, при 22—24° — 5 мин, при 25—27° — 3 мин. По истечении этого времени мазки вынимают, раскладывают на столе намазанной поверхностью кверху.

Недостаточная фиксация мазков дает слабую окраску нейтрофильной зернистости, а недостаточное освобождение мазков от паров фенола ведет к гемолизу эритроцитов при окраске или окрашиванию мазка в красный цвет.

Физический способ фиксации

Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или в руки за рёбра мазком кверху и плавным движением проводят 2—3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с. Надёжность фиксации проверяют: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога (70—80 °С).

Окраска мазков. Принцип.

Все методы окраски мазков основаны гл.обр. на химическом сродстве основных частей клеток к определенным анилиновым краскам и на их физических свойствах. Цитоплазма одних клеток, будучи щелочной, имеет сродство к кислым краскам, выявляя оксифильные элементы крови. Цитоплазма других клеток, содержащих базофильные и нейтрофильные субстанции, поглощает и кислые, и основные краски. Ядра, содержащие в значительном количестве нуклеиновую кислоту, связывают главным образом основные краски.

К основным гематологическим краскам относятся метиленовый синий и его производные— азур I (метиленазур) и азур II (смесь равных частей азура I и метиленового синего), к кислым — водорастворимый желтый эозин. Азур-эозиновые смеси красок обладают высокой чувствительностью к реакции воды и поэтому применяемая дист. вода должна иметь нейтральную реакцию, т. е. рН 7,0. При кислей реакции воды клетки долго не прокрашиваются и имеют красный оттенок. При щелочной реакции эритроциты окрашиваются в серовато-синий цвет, а ядра и цитоплазма клеток — в очень темные цвета.

Окраска по Романовскому Принцип.

Окрашивание различных элементов клеток в разные цвета и оттенки смесью основных (азур II) и кислых (водорастворимый желтый эозин) красок.

Окраска по Романовскому в модификации Филипсона. Принцип.

Применение красителей-фиксаторов, которыми мазки крови в первый период одновременно фиксируются и частично окрашиваются, а во второй период, после разбавления красителей-фиксаторов дистиллированной водой, докрашиваются окончательно.

Окраска по Нохту. Принцип.

Воздействие на фикс. мазок водного раствора смеси основной (азур II) и кислой краски (эозин).

Окраска по Паппенгейму — Крюкову. Принцип.

Комбинированная окраска фиксатором-красителем Мая—Грюнвальда и краской Романовского, дающая возможность очень хорошо дифференцировать составные части клеток.

Окраска по Райту. Принцип

Применение специально приготовленного красителя-фиксатора, дающего наиболее четкую окраску зернистости гранулоцитов, особенно базофилов.

Окраска толстой капли. Принцип.

Мазок до нанесения толстых капель и после не фиксируют, а наливают на него на несколько минут дист. воду для извлечения гемоглобина. Окрашенную гемоглобином воду затем осторожно сливают и на препарат наливают разведенную, как обычно, краску Романовского на 20—30 мин. После окраски препарат осторожно промывают водой, чтобы не смыть каплю, и высушивают на воздухе.

Больший объем крови, чем в мазках, и гемолиз эритроцитов позволяют легче обнаружить в крови малярийные плазмодии, спирохеты возвратного тифа, а также эозинофилы и полихроматофилы.

Клиническое значение. Приведенные методы окраски дают возможность дифференцировать вид клеток, особенности структуры их ядер и цитоплазмы и патологические изменения в них.

По Граму Техника проведения окраски

Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основным, а другой— дополнительным. Кроме красящих веществ применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.

Для окраски по Граму чаще используют анилиновые красители: генциановый, метиловый фиолетовый, кристаллвиолет. Грам (+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при доп. окраске фуксином. Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.

Грам (-) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, а затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.

Способы крашения разделяют на витальный, поствиталъный и негативный, последний может быть витальным и поствитальным.

Витальный способ окраски

Для витального (прижизненного) крашения применяют 0,2-0,001 % водные растворы метиленового и толуоидинового синего, нейтральрот и конго красный, которые добавляют в придавленную или висячую капли культуры. Этим способом выявляют спирохеты, простейшие, определяют подвижность бактерий, иммунное набухание капсулы, но использование его требует строгого соблюдения правил, исключающих лабораторное заражение.

Поствитальные способы окраски (фиксированных препаратов)

Простой способ - красящие растворы фуксина Пфейффера (экспозиция 1-2 мин), метиленового синего (3-5 мин) наносят на фиксированный препарат, так, чтобы он полностью покрыл мазок, краситель сливают, препарат промывают струйкой воды, встряхивают, высушивают и микроскопируют.

Простые способы позволяют судить о величине, форме, локализации, взаимном расположении отдельных клеток, но с их помощью нельзя установить структуру микробов и часто их дифференцированное отношение к красителям.

Из сложных способов крашения бактерий в основном используют дифференцированный способ Грамма, выявление кислотоустойчивости по Циль - Нельсону, определение волютиновых зёрен по Леффлеру или Нейссеру, дифференцирующий способ Романовского - Гимзы, негативно-позитивный способ определения капсулы по Гинсу - Бурри, выявление спор по Цилю — Нельсону и др.

Грибы исследуют неокрашенными или способами Грама, Циль- Нельсона. Леффлера, Романовского - Гимзы, а также раствором Люголя. лактофуксином и др.