Предназначено для выполнения лабораторных работ студентами технологического факультета УГНТУ специальности "Биотехнология" по курсу "Биохимия и прикладная молекулярная биология".

Составитель ПГ'ГУХОВА Н.И., лоц, канд биол наук

Консультант по технике бетпасмоаи I AIM I И И. VI Рецензент СОКОВ Ю.Ф, доц,канд хим наук

^с, Уфимский государственный нефтяной технический университет. 2000

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1

Исследование каталитических свойств протеолитических ферментов

Протеолитические ферменты (протеазы, протеиназы), осуществ­ляющие расщепление белков, имеют большое практическое значение. Они успешно применяются в медицине, в частности,в хирургической практике. Терапевтический эффект этих ферментов при лечении гнойно­воспалительных ран связан с ускорением очищения очага воспаления от мертвых тканей, повышением чувствительности микрофлоры к действию антибиотиков и стимуляцией иммунитета. Кроме того, протеолитические ферменты могут играть немалую роль в детоксикации при различных за­болеваниях, так как они могут расщеплять белковые токсины. Хорошо также известно применение протеаз в качестве добавок к стиральным по­рошкам, для обработки шкур, улучшения качества пищевых продуктов, косметики и т.д.

Протеазы классифицируют по строению активного центра. В соот­ветствии с этим различают четыре группы таких ферментов: сериновые протеиназы_д_металлопротеиназы, цистениовые протеазы и аспартатные протеазы. Сериновые протеазы ингибируются фенилметилсульфонил- флуоридом (PMSF) и диизопропилфлуоридом (DIFP), металлопротеиназы

• хелатирующими агентами, в частности,этилендиаминотетрауксусной ки­слотой (EDTA), цистеиновые ферменты - йодацетамидом и тяжелыми ме­таллами, а аспартатные протеазы - пепстатином. В смеси протеаз эти ин­гибиторы дают возможность измерять активность фермента каждого клас­са без предварительной очистки. Сериновые протеазы имеют оптимумы pH в щелочной области, металлопротеиназы максимально активны при нейтральных pH, а цистеиновые и аспартатные ферменты проявляют наи­большую активность при кислых значениях pH.

Металлопротеиназы - это ферменты, имеющие оптимумы активно­сти при нейтральных или более высоких значениях pH. их молекулярные массы составляют 30 - 40 Ш, они активируются ионами цинка и стабили­зируются ионами кальция. Общим свойством нейтральных протеиназ Bacillus subtilis и бактерий родственных видов является их инактивация при обработке EDTA. Активность ферментов восстанавливается в присут­ствии металлов цинка, кобальта, кальция и некоторых других. Внеклеточ­ные металлопротеиназы выделяются при культивировании штаммами ви­дов В amvloliguefasiens, В thuringiensis. В thermoproteolyticus. В cereus. В megaterium. В. polymyxa и В subtilis. Металлопротеиназы преимущест­венно расщепляют связи с аминогруппами лейцина или фенилаланина.

Целью работы является исследование каталитических свойств протеолитического комплексною препарата, выделенного из культу­ральной жидкости В subtilis

ХОД РАБОТЫ

1. Исследование зависимости скорости ферментативной реакции от времени

Для изучения зависимости скорости протеолитической реакции .от времени (кинетики реакции) проводят ферментативную реакцию в реак­ционной смеси, содержащей субстрат, фермент (протеолитический пре­парат) и буфер. В качестве субстрата используют казеин. Его вносят в ре­акционную смесь в виде раствора в 0,1 М фосфатном буфере - pH 7,6. I/o) Ферментативный препарат вводят в реакционную смесь также в виде рас- твора в 0,1 М фосфатном буфере - pH 7,6. В качестве буфера используют

1. 1 М фосфатный буфер, pH 7,6.

Сначала в пробирку, в которой будет осуществляться реакция, вно­сят субстрат и буфер. Затем эту пробирку помещают в термостат на

10. мин, прогретый до 40 °С. Это необходимо сделать потому, что реакцию требуется проводить при этой температуре. Причем, поскольку реакция протекает с высокой скоростью, важно, чтобы температура реакционной смеси быстро достигла заданной величины.

Последним компонентом, вносимым в реакционную смесь, является фермент, его добавлением запускают реакцию. Содержимое пробирок бы­стро, но тщательно перемешивают, отбирают нулевую пробу и тут же вновь помещают пробирки в термостат.

Через определенные промежутки времени (включая нулевую точку) отбирают пробы по 0,5 мл, в которых останавливают реакцию, "убивая" фермент. В данной работе предлагается " убивать "фермент, добавляя к пробам 0,3 М раствор ТХУ в соотношении I; 1. ТХУ (трихлоруксусная кислота) вызывает денатурашпу белков, сопровождающуюся их осажде­нием. Обработка проб с помошыо ГХУ позволяет не только убить фер­мент, но и приводиг их к удалению и i реакционной смеси. Такое удале­ние необходимо, поскольку >ти полимеры в своем составе содержат ами­нокислоты тирозин и триптофан, которые в дальнейшем будут опреде­ляться в продуктах реакции Образуют и'^-' ч оемдки \'даляют осаждением на улырацентрифуге. Рекомендуется шрлнес разлить раствор ТХУ по

1. 5 мл в центрифужные стаканчики, в которые затем помещают, по мере отбора, пробы реакционной смеси. Следует отбирать пробы, соответст­вующие 0: 4; 8: 12: 16 и 20 мин прохождения реакции. Обработку проб с помощью ТХУ необходимо проводить не менее 10 мин, для того, чтобы сформировался осадок.

Для изучения зависимости активности фермента от концентрации ферментного препарата необходимо исследовать кинетику гидролиза ка­зеина в 4-х вариантах, содержащих различное количество ферментного препарата (концентрация субстрата - постоянна). Объем каждой реакци­онной смеси — 5 мл

Рекомендуется использовать реакционные смеси следующего соста-

ва:

Номер пробы	Раствор казеина, мл	j Фосфатный буфер, мл	! Раствор фермента, мл .
1	4.0	0,75	0.25
f	4,0	0,5	0,5
3	4,0	0,25	0,75
\J 4	4,0	0	1,0

В осветленных суиернатантах определяют концентрацию образую­щихся растворимых низкомолекулярных продуктов гидролиза казеина (такие продукты не осаждаются ТХУ). Для этого используют цветную ре­акцию на аминокислоты тирозин и триптофан, входящие в-состав продук­тов реакции. Методика количественного определения триптофана пред­ставлена в конце работы.

На основании полученных результатов строят [•рафик изменения концентрации тирозина во времени в каждом из вариантов. Рассчитывают начальные скорости реакции и оценивают активности фермента в каждом из вариантов.

По отношению начальной скорости реакции к концентрации белка в ферментном препарате рассчитывают удельную активность фермента, выражают в единицах: мкмол (тирозина)/мг (белка) мин. Концентрацию фермента в реакционной смеси рассчитывают исходя из концентрации фермента в исходном растворе, которую определяют по методу Брэдфор­да, представленного в конце работы. Строят график зависимости удель­ной активности фермента от его концентрации в реакционной смеси.