Лекция № 14 методы биоиндикации и биотестирования. Биомониторинг компонентов окружающей среды и биоты

Биотесты на бактериях

Наиболее часто в качестве тест-организмов используют следующие микроорганизмы: бактерии (рода Bacilus, Pseudomonas, Escherichia), актиномицеты, плесневые грибы, дрожжи. Микроорганизмы широко распространены в природе - они присутствуют в почве, водоемах, илах, воздухе; обладают высокой чувствительностью к действию биологически активных веществ; просты в культивировании и хранении; длительное время сохраняют свои свойства в виде лиофилизированных препаратов.

Методы определения токсичности с использованием микроорганизмов предполагают выращивание их чистых культур на плотных или жидких питательных средах на основе испытуемых проб при постоянных условиях (температуре, рН, воздухообмене, влажности). Учитывают накопление биомассы, выживаемость клеток, нарушение физиологических функций: ферментативной активности, движения и т.п.

Чрезвычайно высокой чувствительностью определения некоторых токсических соединений отличается биолюминесцентный метод, основанный на реакции окисления кислородом воздуха субстрата люциферина, катализируемой ферментами люциферазами, выделенными из различных видов морских светящихся бактерий Photobacterium. Наряду с люциферином и люциферазой для протекания указанной реакции необходима аденозинтрифосфорная кислота (АТФ), которая участвует в многочисленных метаболических реакциях в организме, являясь аккумулятором энергии и ее источником для самых разных процессов, протекающих в живой клетке. Содержание АТФ в тканях, растительных и живых клетках свидетельствует об энергетическом состоянии клеток. При угнетающем или стимулирующем действии каких-либо веществ на рост микроорганизмов содержание АТФ в них соответственно понижается или повышается.

Для тестирования остатков пестицидов, тяжелых металлов в почве и воде используется стандартный микробиотест (Эколюм). Он позволяет определить эффект суммарного присутствия всех токсикантов и токсическое действие широкого круга загрязнителей. В питательную среду на основе водной вытяжки (почва/вода - 1/10) высевают культуру Photobacrterium phosphoreum. Ингибирование люцеферазы количественно регистрируется биолюминометром типа БЛМ 8101.

МЕТОДИКА ЭКСПРЕССНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ВОДЫ С ПОМОЩЬЮ ЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО БАКТЕРИАЛЬНОГО ТЕСТА «ЭКОЛЮМ» (утверждена Руководителем Департамента Госсанэпиднадзора Минздрава России А.А.Монисовым 08 июня 2000 г. МР№ 11-1/133-09). Измерение интенсивности биолюминесценции и индекса токсичности проводят с помощью прибора «Биотокc» согласно инструкции по эксплуатации прибора в стандартном варианте через 30 минут экспозиции. В экспрессном варианте допустимо проведение анализа через 5 минут.

Биотесты на водорослях

Классическим тест-объектом на загрязнители является одноклеточная зеленая водоросль хлорелла. Ее преимущества для экспресс-анализа загрязнения агроценоза заключаются в коротком жизненном цикле и возможности проводить оценку по многим показателям. Тест-функции: пигментное секторирование, нарушение споруляции клеток, динамика нарастания фитомассы и летальность.

Существует альгологическая оценка фитотоксичности гербицидов по методу «бумажных дисков». Оценивается интенсивность роста биоиндикатора Ch.vulgaris в зависимости от концентраций токсиканта. За альгицидные принимают концентрации вещества полностью подавляющие рост водорослей на дисках.

Существуют достаточно надежные способы количественной регистрации воздействия загрязнителей, например, плазмолиз. Для определения количества погибших клеток пользуются методом витального окрашивания. Живые клетки сильно ограничивают проникновение в протоплазму органических веществ, и будучи помещенными в раствор ряда красителей, практически не окрашиваются. В мертвые клетки краска проникает свободно, благодаря чему наличие погибших клеток легко поддается учету.

Есть метод оценки химических веществ, основанный на эффекте замедленной флюоресценции. Этот эффект проявляется у растений при наличии сформированного фотосинтетического аппарата. Гербициды (ингибиторы фотосинтеза) способны изменять интенсивность замедленной флюоресценции, что регистрируется на специальной установке.

Многие методы биологического тестирования основаны на визуальных оценках. Весьма пригодны для этой цели зеленые и диатомовые водоросли. Под действием токсикантов изначально зеленая масса водоросли меняет цвет - становится густо-коричневой или наоборот, обесцвечивается. Некоторые токсиканты не вызывают заметных изменений окраски, однако, водоросли теряют тургор и легко повреждаются.

Есть тесты, основанные на определении скорости движения протоплазмы, которая у многих клеток способна совершать круговые движения (циклозис). Реакция замедления или остановки протоплазмы лучше всего заметна на растениях с удлиненными клетками, такими как харовые водоросли (Charophyta), дюнамилла (Dunamilla) и элодея (Elodea). Присутствие свинца в среде, например, влияет на скорость движения протоплазмы, начиная с концентрации 0,5мг/мл.

Биотесты на высших растениях

Для биотестирования отработано немало методов на различных культурах: белой горчице, озимой и яровой пшенице, овсе, гречихе, огурце, кресс-салате, сое, льне, ежи сборной.

На горчице учитывают степень ингибирования первичного корешка проростка после обработки семян противодвудольным гербицидом. Определяют также увядание растений, торможение прироста листьев надземной массы проростков.

Овес и рис используют как индикаторы почвенных противозлаковых гербицидов, так как это наиболее чувствительные виды среди злаковых культур. При этом основным тестом является ингибирование роста зародышевого корня и листа.

Редис является традиционным биотестом при исследовании остатков пестицидов в почве и конечной продукции растениеводства, т.к. обладает по сравнению с другими объектами как наиболее высокой чувствительностью к фитотоксичным препаратам, что обусловлено высокой энергией прорастания его семян и скороспелостью культуры.

На огурце и гречихе тестируют гербициды - производные мочевины и фенилкарбаматы. При этом у огурца учитывают рост первичного корня, у гречихи - утолщение стебля, деформацию зародышевых листьев, а также торможение роста. Кресс-салат используется как тест - объект для оценки загрязнения воздуха и почвы. Тест длится 10 дней. При наличии вредных веществ снижается процент всхожести и ингибируется рост зародышевых корешков. К недостаткам данного теста можно отнести неспецифичные изменения, затрудняющие выявление конкретного загрязнителя. Очевидно, это объясняется наличием генетической неоднородности культуры.

Действие пестицидов на злаках обнаруживается по их влиянию на морфогенез растений, проявляющейся в изменениях типа морфозов. У озимой пшеницы, при высокой пестицидной нагрузке наиболее распространенным и устойчивым типом морфоза является «мутовка», т.е. увеличение числа колосков на уступе колосового стержня. Колосовые морфозы и фазовый индекс, характеризуя интенсивность воздействия на растение агрохимикатов и других повреждающих факторов, могут быть успешно использованы в качестве диагностической тест- системы.

Успешное применение находят дикорастущие фитотесты в частности из семейства рясковых. Рясковые - самые мелкие цветковые растения, при благоприятных условиях размножаются круглогодично (преимущественно вегетативно). Интенсивность фототаксиса хлоропластов в листецах ряски, оцениваемая по изменению количества хлоропластов в эпистрофном положении, можно рассматривать как чувствительный показатель, свидетельствующий о степени загрязнения элементов агроландшафта. Явление отрицательного фототаксиса и послужило основой метода фитотестирования. Благодаря этим преимуществам ряску можно назвать «экологической дрозофилой»'. Ряска малая и ряска тройчатая, чувствительны к загрязнению воды, при содержании в ней до 10 мкг/мл ионов Ba, Cu, Mg, Fe, Co. На каждый загрязнитель у видов рясок проявляется специфическая реакция. На медь (0,1- 0,.25 мг/мл) - листецы реагируют полным рассоединением групп и изменением окраски с зеленой на голубую; реакция проявляется через 4 часа после воздействия. На цинк (0,025мг/мл) реакция заключается в изменении окраски листеца: с насыщенно зеленой до бесцветной; где зелеными остаются только точки роста; барий (0,1-0,25 мг/мл) вызывает полное рассоединение листецов, отпадание корней и изменение окраски с зеленой на молочно-белую; кобальт (0,25-0,0025 мг/мл) - полную приостановку роста и потерю окраски.

Биотесты на мхах

Метод индукции флюоресценции хлорофилла позволил исследовать активность фотосинтетического аппарата у ряда растений при изменении внешних условий среды. Эта особенность хлорофилла была предложена в качестве индикаторного признака нарушений, вызванных воздействием поллютантов. Удобным объектом для исследований послужил листовой мох Mnium hotnum L., у которого хорошо просматривается однослойная структура гаметофита. Модулируемое (путем переключения световых и темновых фаз) развитие флюоресценции суспензии хлоропластов служит критерием степени загрязнения воздуха двуокисью серы.

Биотесты на беспозвоночных

Наиболее изученными с точки зрения использования в аналитических целях являются инфузории Paramecium caudatum. Поведенческие реакции (хемотаксис), скорость размножения инфузорий используют для определения токсических веществ.

Водных беспозвоночных - ракообразных (чаще всего ветвистоусых рачков дафний) широко применяют для оценки санитарно-гигиенического состояния вод. В качестве аналитического сигнала в этом случае используют некоторые физиологические показатели: выживаемость, поведенческие реакции, частоту движения ножек, период сокращения сердца (у дафний), окраску тел погибших организмов. Патологические процессы в организмах в зависимости от концентрации определяемого химического соединения могут протекать быстро: сначала наблюдается общее возбуждение, переходящее в депрессию, а затем в результате нарушения деятельности органов движения, дыхания, кровеносной и нервной систем наступают потеря подвижности и летальный исход.

Регистрацию изменения скорости и траектории движения, фототаксического поведения насекомых (личинок комаров - хирономид, жука долгоносика, дрозофилы), выживаемости этих организмов используют для определения остаточных количеств пестицидов в воде, экстрактах из почв, растительных и животных тканях.

Наблюдения под микроскопом формы и скорости движения червей, например нематод, пиявок и коловраток, фиксирование продолжительности их жизни позволяют определять микроколичества ионов металлов. В зависимости от концентрации металла в растворе нематоды ведут себя по-разному: в разбавленных растворах они быстро изгибаются то в одну, то в другую сторону, совершая как бы S-образные движения; с повышением концентрации движения становятся вялыми, замедляются. При достижении определенной критической концентрации металла организмы могут погибнуть, о чем свидетельствует выпрямление их тел. Методами последовательного разбавления анализируемого раствора до отрицательной реакции нематод на введение ионов, а также фиксирования продолжительности их жизни в зависимости от концентрации ионов металлов возможно определение микрограммовых количеств серебра, кадмия, цинка и меди.

Биотесты на позвоночных

Классическими индикаторными организмами, широко используемыми для решения многих медико-биологических проблем, являются амфибии, рыбы. На изолированных органах и тканях лягушки, либо на всем организме проверяется физиологическая активность многих фармацевтических препаратов. Биопотенциал нервной ткани можно использовать в качестве индикатора для определения концентрации кислот и щелочей, некоторых тяжелых металлов. По усилению либо угнетению биоэлектрической активности седалищного нерва лягушки можно оценить содержание хлорида марганца на уровне 1 нМ либо 1 мкМ соответственно.

В биологических методах анализа возможно использование вазомоторных реакций организма млекопитающих. Известны несколько путей, по которым реализуется действие химических соединений на тонус сосудов: мембрану гладкомышечных тканей, метаболизм сосудов, специфические клеточные рецепторы сосудов и т.д. Высокой чувствительностью к микроэлементам обладают мозговые сосуды, что позволяет определять следовые количества кадмия, ртути, свинца, марганца, кобальта, никеля, меди; при этом предел обнаружения, например, меди(II) составляет 0,6 нг.

В последние годы наиболее правомочным представляется подход, основанный на применении многокомпонентных тест-систем, подобранных с учетом целевого назначения и особенностей контролируемых показателей. Анализ данных литературы позволяет очертить круг основных требований, предъявляемых к подобным системам:

наличие в составе прокариотических и эукариотических организмов;

содержать представителей двух трофических уровней – автотрофов и гетеротрофов;

включать тест-организмы, хорошо растущие в лабораторных условиях;

включать организмы, отличающиеся наиболее высокой чувствительностью к наиболее типичным загрязнителям;

преимущество следует отдавать организмапм с широким ареалом распространения, с хорошо изученной экологией и биологией;

включать тест-реакции, регистрация которых не требует применения сложной и дорогостоящей аппаратуры, но в то же время несущих достаточный объем информации.

Пример такой системы для оценки токсичности почв Уральского региона: синехоцистис водяной (цианобактерия, прокариот, автотроф); хлорелла обыкновенна (низшее растение, эукариот, автотроф); пенициллиум циклопиум (микроскопический гриб, эукариот, гетеротроф, сапрофит); овес посевной. На основании изучения рассчитывают индекс токсичности оцениваемого фактора по отношению к контролю.

Биологический мониторинг почв