3. Регуляция на посттранскрипционном уровне: модификации (сплайсинг) мРнк

Регуляция на уровне процессинга РНК обес­печивает возможность образования различных типов зрелой, функционально активной мРНК. Процессинг РНК регулируется с помощью рибозимов (катализаторов рибонуклеиновой природы) и ферментов матураз.

Одной из форм сплайсинга является альтернативный сплайсинг, при котором одному участку ДНК и одному первичному транскрипту (пре-мРНК) может соответствовать несколько типов зрелой мРНК и, соответственно, несколько изотипов (т.е. разных форм) одного и того же белка, например, мышечного белка тропонина. Твердо установлено, что некоторые генетические заболевания человека (фенилкетонурия, некоторые гемоглобинопатии) обусловлены нарушением сплайсинга.

Сплайсинг РНК открыт сравнительно недавно, поэтому достоверных данных по регуляции активности генов на этом уровне недостаточно. Наиболее подробно изучена регуляция генов, контролирующих усвоение галактозы у дрожжей. Показано, что эти системы регуляции действуют как на уровне транскрипции, так и на посттранскрипционном уровне. При этом осуществляется многоступенчатая, или каскадная, регуляция, в которой участвуют элементы позитивного и негативного контроля, последовательно регулирующие активность друг друга.

 

4. Регуляция на уровне трансляции

Регуляция на уровне трансляции обусловлена различной активностью разных типов мРНК. Например, у прокариот некоторые мРНК транслируются только в присутствии эритромицина. У эукариот регуляция генной активности на уровне трансляции хорошо прослежена на примере морского ежа. Его неоплодотворенные яйца содержат большое количество «замаскированной» (нетранслируемой) мРНК. У дрозофилы подобные мРНК, кодирующие белки оболочки яйцеклетки, накапливаются в цитоплазме.

 

5. Регуляция на уровне посттрансляционной модификации белков.

Экспрессия генов на уровне посттрансляционной модификации полипептидов регулируется путем посттрансляционной модификацией белков (фосфорилированием, ацетилированием, расщеплением исходной полипептидной цепи на более мелкие фрагменты и т.д.). Например, белковый гормон инсулин, синтезирующийся в клетках поджелудочной железы, образуется в форме препроинсулина, из которого затем путем отщепления «лишних» пептидов образуется проинсулин. Из проинсулина вырезаются две субъединицы, представляющие собой А- и В-цепи инсулина. Эти две цепи сшиваются между собой с помощью дисульфидных мостиков. Четыре образовавшиеся АВ-структуры соединяются в белковый тетрамер, который присоединяет два иона Zn²⁺, и в результате образуется зрелый инсулин.

Широко распространен механизм регуляции активности ферментов, основанный на присоединении к ним молекул-эффекторов. Чаще всего в роли эффекторов выступают конечные продукты цепей биосинтеза, которые связываются с первым или с одним из первых ферментов данного метаболического пути и подавляют его активность, тем самым выключая всю цепь синтеза. Это ингибирование конечным продуктом, благодаря которому регулируются сразу несколько этапов метаболизма. Конечный продукт связывается с ферментом не в его активном центре, а в аллостерическом центре, и такое взаимодействие индуцирует изменение (инактивацию) активного центра фермента.

© Афонин Алексей Алексеевич

Доктор с.-х. наук, профессор кафедры зоологии и анатомии Брянского государственного университета

Зав. лабораторией популяционной цитогенетики НИИ ФиПИ БГУ

главная страница сайта ОБЩАЯ И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ http://afonin-59-bio.narod.ru

e-mail: afonin.salix@gmail.com

дополнительные web-ресурсы

http://afonin-59-salix.narod.ru

http://darwin200.narod.ru

http://lib-58-timob.narod.ru

последнее обновление страницы 28.10.2010

Молекулярные основы наследственности составляют нуклеиновые кислоты - ДНК (у всех микробов, одноклеточных, растительных организмов, насекомых, животных) и РНК (у некоторых вирусов, в частности онкогенных). Именно в этих крупных биополимерах с помощью единого языка, алфавит которого составляют 4 буквы - нуклеозиды, записана генетическая информация живых существ. В ДНК информация изложена чередованием аденина (А), тимина (Т), гуанина (Г) и цитозина (Ц), которые образуют определенные последовательности, связываясь остатками дезоксирибозы и фосфором в одноцепочечных молекулу.

Потом два комплементарные друг другу цепи образуют водородные связи: аденин-тимин (AT) и гуанин-цитозин (ГЦ), которые закручиваются и образуют двойную спираль, преимущественно правовинтовую, одновременно биологическое и информационную, "змеиные лестница"). Молекула РНК имеет односпиральну структуру. В ее состав вместо тимина входит урацил (У), а вместо остатка дезоксирибозы - рибоза (химически несколько иная пентоза).

Молекула нуклеиновой кислоты (НК) имеет способность к размножению, удвоение или репликации. Размножаются, тиражируются не белки, а нуклеиновые кислоты. При наличии необходимых компонентов и соответствующих ферментов на матрице каждой нити двуспиральной ДНК (после их разъединения) синтезируется комплементарный цепь новой ДНК. Репликация должна полуконсервативной, матричный характер. В каждой двуспиральные молекуле содержится и материнский (старый), и дочерний (новый) цепь нуклеотидов.

На уровне одноклеточных организмов нет смерти от старости. Этот механизм обеспечивает стабильность генетической информации, ее сохранность при процессе передачи потомкам.

При реализации генетической информации происходит декодирование: речь нуклеиновых кислот (четыре буквы А, Т, Г, Ц) должна быть переведена на язык белков (20 аминокислот, условно 20 букв). Это возможно благодаря кодовому принципу: одной аминокислоте соответствует запись из трех нуклеотидов в нуклеиновой кислоте. Например, последовательность аденин, аденин, аденин (ААА) кодирует фенилаланин, а АТТ - лизин. Поэтому генетический код - триплетных. Но с 4 букв (А, Т, Г, Ц) можно получить 64 различные комбинации по 3 буквы (43 = 64), а в природе существует только 20 аминокислот.

Другие триплеты (кодоны) - сочетание трех нуклеотидов - не лишние. Три из них (АТЦ АЦТ, АТТ) - терминуючи, они свидетельствуют о конце синтеза, знаки препинания (как в языке - точка, запятая и т.д.). Другие обеспечивают запас прочности генома, так кодирующих те же аминокислоты, что и основные триплеты. Поэтому генетический код - вырожденный: одна аминокислота может быть закодирована в ДНК 2-4 триплетами. В одном гене кодоны расположены друг за другом, как слова в предложении, не перекрываются, что упрощает запись и делает его стабильным.

Генетический код не перекрывается. У всех живых организмов на Земле в генетической программе те же триплеты кодируют те же аминокислоты. Генетический код еще и в н и ве реальный. Имеем запомнить признаки генетического кода / триплетных, вырожденный, не перекрывается, универсальный. Но в каждом правиле существуют исключения. В последние ЗО лет исследователи изучали и собирали такие исключения, их оказалось много, возникли новые гипотезы и теории, что и привело к возникновению современной мобильной генетики, которая пришла на смену генетике классической. Сейчас мы знаем, что:

1. генетическая программа не совсем стабильной: существуют мобильные диспергированные гены, или элементы, меняющие свое положение, прыгают с места на место;

2. внутри гена существуют участки с содержанием (Экзоны) и без него (интроны);

3. большое количество информации имеет регуляторные функции;

4. ген - обладает свойством делиться;

5. в геноме имеют место не только уникальные кодирующие последовательности, но и огромное количество повторов информации;

6. запись генетической информации УЮЖЕ отличаться от универсального.

Информационные молекулы содержатся в клетках не только в ядре (основная, самая программа), но и в некоторых органеллах цитоплазмы: митохондриях, плазмидах, других ДНК-или РНК-носителях. Так в митохондриях код отличается от универсального.

Реализация генетической информации, а именно синтез белка, осуществляется в цитоплазматических структурах - рибосомах. Для того чтобы план строения белка донести от ДНК к рибосом, клетка имеет специальные механизмы и подвижные молекулы. Из того, что знаем сейчас, механизм называется транскрипцией, а молекулы - это различные виды РНК. Транскрипция означает переписывание информации с ДНК на РНК. Главным же в синтезе белка является трансляция - перевод информации с одного языка на другой.

Кодовый запись о структуре белковой молекулы переносится с ДНК на информационную (матричную) РНК (она же РНК-переносчик, лат. "Мессенджер", синонимы: иРНК, мРНК, т-РНК) путем комплементарного, матричного синтеза РНК на ДНК, сравнимый с репликацией (синтез ДНК на ДНК). Молекула РНК копирует весь ген эукариот вместе с незначимыми интроны. Такие временные молекулы называются пре-иРНК.

Молекулы пре-иРНК перемещаются из ядра к цитоплазме, а именно к рибосом, состоящие из рибосомных РНК (рРНК) и белков. По пути пре-иРНК модифицируются, из них удаляются незначащие участки кода (интроны). Значение интронов, видимо, очень важное, но еще полностью не расшифровано.

Третий вид РНК составляют относительно маленькие (десятки нуклеотидов) молекулы транспортных РНК (тРНК), которые приносят к рибосом специфические активированные аминокислоты, ставят их на соответствующее место в полипептидной цепи, определенное кодоном иРНК. Только молекула тРНК имеет в своем составе антикодон, комплементарный к кодону иРНК.

Мы уже определили, чем РНК отличается от ДНК. Белок синтезируется по плану иРНК, поэтому и триплеты, кодирующие аминокислоты, чаще записываются комплементарной языке РНК, для фенилаланина это будет УУУ, терминуючи кодоны УАГ, УГА, УАА.

Таким образом процесс реализации наследственной информации от гена к фену (синтез белка - один из них) имеет вид ДНК> РНК> белок. Долгое время эта формула считалась центральной догмой генетики.

В наше время мобильной генетики установлено существование процесса переноса информации от РНК к ДНК. Обратная транскрипция была предусмотрена И открыта С.М Гершензоном и экспериментальное окончательно доказана лауреатом Нобелевской премии Г. М. Темин. Если к этому добавить репликацию ДНК на ДНК и РНК на РНК (возможно, существует в некоторых вирусов), то окончательный запись потока информации будет иметь такой вид:

Синтез нуклеиновых кислот на матрице белка пока не доказан и, наверное, блокирован законами термодинамики. Для его проблематичного существования необходимыми должны быть неизвестны нам энергоснабжающие источники.

В конце XX в. стало известно, что в генотипе человека содержится 50-100 тыс. различных генов. Они кодируют продукты, необходимые для существования клетки (кухонные гены), организму (гены роскоши), или, по нашему мнению, не кодирующие ничего. Последние сейчас называются эгоистичными генами, избыточной генетической информацией, который может содержать или память о прошлой эволюции, или быть резервом (планом) будущей эволюции.

Весь объем генетической информации находится под строгим контролем регуляторных механизмов. Все гены взаимодействуют между собой, образуя единую систему. Регуляция их активности происходит как за относительно простой схеме - продукт гена изменяет активность того или иного гена, так и путем сложного многоуровневого механизма. Он включает процессы регуляции активности генов на этапах транскрипции (до, во время и после нее), трансляции (до, во время и после нее), согласованной, каскадной групповой регуляции трудовой генов (их экспрессия), участия в этом процессе гормонов (общие сигнальные вещества), химической модификации ДНК и других общих модификаторов экспрессии генов. Экспрессия отдельного гена зависит от того, в каком составе (генотипе) этот ген находится. Поэтому существует разная пенетрантнисть (проявка) и экспрессивность (выражение) генов как нормальных (дикий тип), так и мутантных аллелей.

Эти понятия впервые введены в генетику М.В.Тимофеевим-Ресовский. Конкретный генотип человека определяет степень пенетрантности и экспрессивности определенных болезней, даже в отсутствии клинической картины патологии при наличии, казалось бы, необходимого количества мутантных генов.

8. Генетика микроорганизмов.

- Особенности строения наследственного материала микроорганизмов.

-Явление лизогении.

-Особенности обмена генетическим материалом у вирусов и бактерии.

-Трансформация и гибридизация в культурах клеток высших организмов.

-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ИЗМЕНЧИВОСТИ микроорганизмов.

Тема: ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ

Вопросы: 1. Особенности строения наследственного материала.

2. Изменчивость.

3. Генетические рекомбинации.

4. Плазмиды.

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ИЗМЕНЧИВОСТИ микроорганизмов.

Микроорганизмы обла­дают выраженной морфологией, которую можно изучать визуально при помощи светового микроскопа. Микроорга­низмы биохимически активны, что легко учи­тывать при использо­вании специальных питательных сред.

Способность микроорганизмов изменять свои свойства при воздей­ствии различных факторов (температура, уль­трафиолетовое и рент­геновское излучение и др.) позволя­ет широко использовать их в ка­честве модели при изуче­нии наследственности и изменчивости.

Первым объектом генетических исследований была кишечная па­лочка, которая хорошо культивируется в лабораторных условиях. Важное значение имело также то, что морфологические, культураль­ные и биохимические свойства этой бактерии хорошо изучены. В дальнейшем объектом генетических исследований стали и другие бак­терии, а также вирусы.

Исследования генетики микроорганизмов показали, что у них роль носителя генетической информации играет ДНК (у некоторых виру­сов РНК).

Молекула ДНК в бактериях состоит из двух нитей, каждая из кото­рых спирально закручена относительно другой. При делении клетки нитчатая спираль удваивает­ся— каждая из нитей служит как бы шаблоном или матрицей, на которой строится новая нить. При этом каждая нить, возникшая в процессе деления клеток, содержит вновь образовавшуюся двунитчатую молекулу ДНК.

В состав ДНК входят четыре азотистых основания — аденин, гуа­нин, цитозин и тимин, порядок располо­жения в цепи у разных ор­ганизмов определяет их наслед­ственную информацию, закодиро­ванную в ДНК.

Функциональной единицей наследственности является ген, который представляет собой участок нити ДНК. В генах записана вся информа­ция, касающаяся свойств клетки.

Полный набор генов, которым обладает клетка, называется генотипом. Гены подразделяются на структурные, несущие информацию о конкрет­ных белках, вырабатываемых клеткой, и гены-регуляторы, регулирую­щие работу структурных генов. Например, клетка вырабатывает те белки, которые необходимы ей в данных условиях, однако при измене­нии условий гены-регуляторы изменяют свойства клетки, приспосабли­вая их к новым условиям.

ИЗМЕНЧИВОСТЬ

Изменения морфологических, культуральных, биохимических и других свойств микроорганизмов, возникающие под действием внешних фак­торов, взаимосвязаны. Например, изменения морфологических свойств сопровождаются обычно изменениями физиологических особенностей клетки.

В процессе изучения изменчивости микроорганизмов была обнаружена особая форма изменчивости — диссоциация. Этот вид изменчивости был описан П. де Крюи и Дж. Аркаерайтом и выражтся в том, что при посеве некоторых бактериальных культур на плотные питательные среды происходит разделе­ние колоний на два типа:

-гладкие, круглые, блестящие колонии с ров­ными краями — S-форма (от англ. smooth — гладкий), и

-плоские, непро­зрачные колонии неправильной формы, с неровными краями — R-форма (от англ. rough— шероховатый).

Существуют также

-переходные формы: - М-формы (слизистые) и

- g-формы (карликовые).

Колонии, относящиеся к гладкой S-форме, могут при определенных ус­ловиях переходить в R-форму и обратно, однако переход R-формы в S-форму происходит труднее.

Диссоциация наблюдается у ряда бактерий, в частности у возбудителей сибирской язвы, чумы и др.

Характеристика S- и R-форм колоний

S-форма

Колонии гладкие, блестящие, правильной выпуклой "формы

При росте в бульоне — равномерная муть

У подвижных бактерий имеются жгутики

У капсульных бактерий имеется капсула

Биохимически активны

Болезнетворны

Выделяются чаще в остром периоде заболевания

R-форма

Колонии неправильной формы, мутные, шероховатые

Растут в бульоне в виде осадка

У подвижных бактерий жгутики могут отсутствовать

Капсулы отсутствуют

Биохимические свойства выражены слабо

Большинство бактерий менее болезнетворны

Выделяются обычно при хронической форме заболевания

Болезнетворные бактерии чаще бывают в S-форме. Исключением яв­ляются возбудители туберкулеза, чумы, сибирской язвы, у которых бо­лезнетворной является R-форма .

Изменения, возникающие в бактериальных клетках могут быть:

- нена­следуемые — фенотипическая изменчи­вость и

- наследуемые — генотипи­ческая изменчивость.

ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ (МОДИФИКАЦИЯ)

Модификация микроорганизмов возникает как от­вет клетки на не­благоприятные условия ее существования. Это адаптивная реакция на внешние раздражители. Модификация не сопровождается измене­нием генотипа, в связи с чем возникшие в клетке изменения по наслед­ству не передаются. При восстановлении оптимальных ус­ловий воз­никшие изменения утрачиваются. Модификация может касаться раз­ных свойств микроорганизмов — морфологических, культуральных, биохимических и др.

Морфологическая модификация выражается в изменениях формы и величины бактерий. Например, при добавлении пенициллина к питательной среде клетки некоторых бактерий удлиняются. Недоста­ток в среде солей кальция вызывает у палочки сибирской язвы повы­шенное спорообразование. При повышенной концентрации солей кальция способность образовывать споры утрачива­ется и т. д. При дли­тельном росте бактерий в одной и той же среде возникает полимор­физм, обусловленный влияни­ем накопившихся в ней продуктов их жизнедеятельности.

Культуральная модификация состоит в измене­нии культуральных свойств бактерий при изменении соста­ва питательной среды. Напри­мер, при недостатке кислоро­да у стафилококка утрачивается способ­ность образовы­вать пигмент. Чудесная палочка при комнатной температу­ре образует ярко-красный пигмент, но при 37 °С способ­ность образовывать этот пигмент утрачивается и т. д.

Биохимическая (ферментативная) модифи­кация. Каждый вид бактерий имеет определенный набор ферментов, благодаря которым они усваивают питатель­ные вещества. Эти ферменты вырабатываются на опреде­ленных питательных субстратах и предопределены ге­нотипом.

В процессе жизнедеятельности бактерий обычно функ­ционируют не все гены, ответственные за синтез соответ­ствующих ферментов. В геноме бактерий всегда имеются запасные возможности, т. е. гены, определяющие выра­ботку адаптивных ферментов. Например, кишечная палочка, растущая на среде, не содержащей углевод лактозу, не вырабатывает фермент лактазу, но если пересеять ее на среду с лактозой, то она начинает вырабатывать этот фермент. Адаптивные ферменты позволяют приспособ­ляться к определенным условиям существования.

Таким образом, модификация — это способ приспособ­ления микроорганизма к условиям внешней среды, обеспе­чивающий им возможность расти и размножаться в измененных условиях. Приобретенные свойства не переда­ются по наследству, поэтому они не играют роли в эволюции, а способствуют в основном выживанию мик­робных популяций.

ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ (НАСЛЕДУЕМАЯ) ИЗМЕНЧИВОСТЬ

Генотипическая изменчивость может возникать в резуль­тате мутаций и генетических рекомбинаций.

Мутации (от лат. mutatio — изменять) — это передава­емые по наследству структурные изменения генов.

Крупные мутации (геномные перестройки) сопро­вождаются выпадением или изменением относительно крупных участков генома — такие мутации, как правило, необратимы.

Мелкие (точковые) мутации связаны с выпадением или добавлением отдельных нуклеотидов ДНК. При этом изменяется лишь небольшое число признаков. Такие измененные бактерии могут полностью возвращаться в исходное состояние (ревертировать).

Бактерии с измененными признаками называются му­тантами. Факторы, вызывающие образование мутантов, носят название мутагенов.

Бактериальные мутации делят на спонтанные и индуци­рованные. Спонтанные (самопроизвольные) мутации возникают под влиянием неконтролируемых факторов, т. е. без вмешательства экспериментатора. Индуциро­ванные (направленные) мутации появляются в результа­те обработки микроорганизмов специальными мутагенами (химическими веществами, излучением, температурой и

др.).

В результате бактериальных мутаций могут отмечать­ся: а) изменение морфологических свойств; б) изменение культуральных свойств; в) возникновение у микроорганиз­мов устойчивости к лекарственным препаратам; г) потеря способности синтезировать аминокислоты, утилизировать углеводы и другие питательные вещества; д) ослабление болезнетворных свойств и т. д.

Если мутация приводит к тому, что мутагенные клетки обретают по сравнению с остальными клетками популяций преимущества, то формируется популяция из мутантных клеток и все приобретенные свойства передаются по наследству. Если же мутация не дает клетке преимуществ, то мутантные клетки, как правило, погибают.

Генетические рекомбинации.

Трансформация. Клет­ки, которые способны воспринять ДНК другой клетки в процессе трансформации, называются компетентными.

Трансдукция — это перенос генетической информа­ции (ДНК) от бактерии донора к бактерии реципиенту при участии бактериофага. Трансдуцирующими свойствами обладают в основном умеренные фаги. Размножаясь в бактериальной клетке, фаги включают в состав своей ДНК часть бактериальной ДНК и передают ее реци­пиенту.

Различают три типа трансдукции: общую, специфи­ческую и абортивную.

1. Общая трансдукция — это передача различных генов, локализованных на разных участках бактериальной хромосомы. При этом бактерии доноры могут передать реципиенту разнообразные признаки и свойства— способность образовывать новые ферменты, устойчивость к лекарственным препаратам и т. д.

2. Специфическая трансдукция — это передача фагом только некоторых специфических генов, локализо­ванных на специальных участках бактериальной хромосо­мы. В этом случае передаются только определенные •признаки и свойства.

3. Абортивная трансдукция — перенос фагом ка­кого-то одного фрагмента хромосомы донора. Обычно этот фрагмент не включается в хромосому клетки реципи­ента, а циркулирует в цитоплазме. При делении клетки реципиента этот фрагмент передается только одной из двух дочерних клеток, а второй клетке достается неизме­ненная хромосома реципиента.

С помощью трансдуцирующих фагов можно передать от одной клетки другой целый ряд свойств, таких как способность образовывать токсин, споры, жгутики, проду­цировать дополнительные ферменты, устойчивость к ле­карственным препаратам и т. д.

Конъюгация — это передача генетического матери­ала от одной бактерии к другой при непосредственном контакте клеток. Клетки, передающие генетический мате­риал, называются донорами, воспринимающие его — реципиентами. Этот процесс носит односторонний характер — от клетки донора к клетке реципиента.

Бактерии донора обозначаются F+ (мужской тип), а бактерии реципиента — F — (женский тип). При тесном сближении клеток F+ и F- между ними возникает цитоплазматический мостик. Образование мостика контро­лируется фактором F (от англ.Fertility— плодовитость). Этот фактор содержит гены, ответственные за образова­ние половых ворсинок (sex-pili). Функцию донора могут выполнять только те клетки, которые содержат фактор F. Клетки реципиента лишены этого фактора. При скрещива­нии фактор F передается клеткой донора реципиенту. Получив фактор F, женская клетка сама становится донором (F+).

Процесс конъюгации можно прервать механическим способом, например встряхиванием. В этом случае реципи­ент получает неполную информацию, заключенную в ДНК.

Перенос генетической информации путем конъюгации лучше всего изучен у энтеробактерий.

Конъюгация, как и другие виды рекомбинации, может осуществляться не только между бактериями одного и того же вида, но и между бактериями разных видов. В этих случаях рекомбинация называется межви­довой.

ПЛАЗМИДЫ

Плазмиды — это сравнительно небольшие внехромо-сомные молекулы ДНК бактериальной клетки. Они распо­ложены в цитоплазме и имеют кольцевую структуру. В плазмидах содержится несколько генов, функционирующих независимо от генов, содержащихся в хромосомной ДНК.

Типичным признаком плазмид служит их способность к самостоятельному воспроизведению (репликации).

Они могут также переходить из одной клетки в другую и включать в себя новые гены из окружающей среды. К числу плазмид относятся:

Профаги, вызывающие у лизогенной клетки ряд изме­нений, передающихся по наследству, например способ­ность образовывать токсин (см. трансдукцию).

F-фактор, находящийся в автономном состоянии и принимающий участие в процессе конъюгации (см. конъ­югацию).

R-фактор, придающий клетке устойчивость к лекар­ственным препаратам (впервые R-фактор был выделен из кишечной палочки, затем из шигелл). Исследования пока­зали, что R-фактор может быть удален из клетки, что вообще характерно для плазмид.

К-фактор обладает внутривидовой, межвидовой и даже межродовой трансмиссивностью, что может явиться при­чиной формирования трудно диагностируемых атипичных штаммов.

Бактериоциногенные факторы (col-факторы), которые впервые были обнаружены в культуре кишечной палочки (E.coli), в связи с чем названы колицинами. В дальней­шем они были выявлены и у других бактерий: холерного вибриона — вибриоцины, стафилококков — стафилоцины и др.

Соl-фактор — это маленькая автономная плазмида, ко­торая детерминирует синтез белковых веществ, способ­ных вызывать гибель бактерий собственного вида или близкородственного. Бактериоцины адсорбируются на по­верхности чувствительных клеток и вызывают нарушения метаболизма, что приводит клетку к гибели.

В естественных условиях только единичные клетки в популяции (1 на 1000) спонтанно продуцируют колицин. Однако при некоторых воздействиях на культуру (обра­ботка бактерий УФ-лучами) количество колицинпродуцйрующих клеток увеличивается.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ИЗМЕНЧИВОСТИ микроорганизмов

Еще Пастер искусственным путем получил необрати­мые изменения у возбудителей бешенства, сибирской язвы и приготовил вакцины, предохраняющие от этих заболеваний. В дальнейшем исследования в области генетики и изменчивости микроорганизмов позволили получить большое число бактериальных и вирусных штаммов, используемых для получения вакцин.

Результаты исследования генетики микроорганизмов с успехом были использованы для выяснения закономерностей наследственности высших организмов.

Большое научное и практическое значение имеет также новый раздел генетики — генная инженерия.

Методы генной инженерии позволяют изменять структуру генов и включать в хромосому бактерий гены других организмов, ответственных за синтез важных и нужных веществ. В результате микроорганизмы становятся продуцентами таких веществ, получение которых химическим путем представляет очень сложную, а иногда даже невозможную задачу. Этим путем в настоящее время получают такие медицинские препараты, как инсулин, интерферон и др. При использовании мутагенных факторов и селекции были получены мутанты-продуценты антибиотиков, которые в 100—1000 раз активнее исходных.

9. Генетика иммунитета

-генетическая детерминированность иммунной реакции организма высших животных;

-механизм синтеза моноспецифических антител и иммунная память;

-наследуемость уровня иммунной реакции организма и возможности селекции животных по устойчивости к инфекциям.

Иммунитет – это невосприимчивость организма к инфекционным агентам и генетически чужеродным веществам антигенной природы. Главная функция иммунитета – иммунологический надзор за внутренним постоянством (гомеостазом) организма.

Следствием этой функции является распознавание, а потом блокирование, нейтрализация или уничтожение генетически чужеродных веществ (вирусов, бактерий, раковых клеток и т.д.). За сохранение генетически обусловленной биологической индивидуальности отвечает иммунная система организма – совокупность всех лимфоидных клеток (специфический фактор защиты ). К неспецифическим факторам защиты относят кожные и слизистые покровы. Иммунный ответ, или иммунологическая реактивность – форма реакций организма на чужеродные вещества (антигены). Главной функцией антител является их способность вступать в быструю реакцию с антигеном в виде реакции глютинации, преципитации, лизиса, нейтрализации.

10. Группы крови и биохимический полиморфизм.

-понятие о группах крови;

-наследуемость групп крови;

-практическое применение групп крови в животноводстве;

-полиморфные системы белков и их связь с продуктивностью животных;

-методы определения групп крови и полиморфных систем белков.

Группы крови были открыты в 1900 г. (у человека) и объяснены в 1924 г. А в 1936 году использован термин иммуногенетика. В пределах вида особи различаются по ряду охимических, генетически детерминируемых признаков, которые могут быть выявлены иммуногенетически в виде антигенов (генетически чужеродные вещества, при введении их в организм вызывают иммуногенетических реакций). Антитела – иммуноглобулины (белки), образующие в организме под воздействием антигенов, различия в групповой принадлежности крови определяются антигенами, расположенными на поверхности эритроцитов. Антигенные факторы иногда называют кровяными факторами, сумму всех групп крови одной особи – типом крови. После рождения группы крови у животных не меняется.. Генетические системы групп крови и антигены обозначают прописными и строчными буквами – А,В,С и т.д. Количество антигенов много, поэтому пишут со значками А, В, С, и с подстрочными индексами А1, А2 и т.д.

У всех видов животных большинство аллелей генетических систем групп крови наследуется по типу кодоминирования, т.е. в гетерозиготе фенотипически проявляются оба гена. Все известные системы групп крови у с/х животных локализованы в аутосомах. Можно выделить три правила наследования групп крови:1) каждая особь наследует по одному из двух аллелей от матери и отца по каждой системе групп крови;

2) Особь с антигенами, не обнаруженными хотя бы у одного из родителей, не может быть потомком данной пары родителей;

3) Гомозиготная особь по одному антигену, например F/F, не может быть потомком гомозиготной особи с противоположным антигеном, например V/V. В настоящее время у крупного рогатого

Контроль достоверности происхождения животных возможен благодаря: 1) кодоминантному наследованию антигенных факторов;2) их неизменности в течение онтогенеза; 3) огромному числу комбинации групп крови, которые в пределах вида не бывают одинаковыми у двух особей, за исключением монозиготных близнецов.

Полиморфизм – это одновременное присутствие двух или более генетических форм одного вида. Термин генетический (биохимический) полиморфизм применяется тогда, когда локус хромосомы в популяции имеет два или более аллелей. Ген, представленный более, чем одним аллелем , называют полиморфным геном.

11. Генетическая инженерия.

-генная инженерия: получение рекомбинантных молекул, внедрение рекомбинантных молекул, производство продуктов с помощью ГеноМодифицированных клеток и Организмов;

-клеточная инженерия: получение моноклональных антител на основе гибридом; использование мезенхимальных и эмбриональ-ных стволовых клеток в лечении болезней и аномалии; выращивание культур клеток и клонирование низших организмов и высших животных.

Раздел "Генная инженерия" Введение в генетическую инженерию Возможности генной инженерии Важной составной частью биотехнологии является генетическая инженерия. Родившись в начале 70-х годов, она добилась сегодня больших успехов. Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в "фабрики" для масштабного производства любого белка. Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средств. В настоящее время кишечная палочка (E. coli) стала поставщиком таких важных гормонов как инсулин и соматотропин. Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной железы животных, поэтому стоимость его была очень высока. Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800-1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200 - 250 грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков. В 1978 году исследователи из компании "Генентек" впервые получили инсулин в специально сконструированном штамме кишечной палочки. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот. При соединении их дисульфидными связями образуется нативныйдвухцепочечный инсулин. Было показано, что он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается. Впоследствии в клетках E. coli был осуществлен синтез проинсулина, для чего на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезировали ее ДНК-копию. После очистки полученного проинсулина его расщепили и получили нативный инсулин, при этом этапы экстракции и выделения гормона были сведены к минимуму. Из 1000 литров культуральной жидкости можно получать до 200 граммов гормона, что эквивалентно количеству инсулина, выделяемого из 1600 кг поджелудочной железы свиньи или коровы. Соматотропин - гормон роста человека, секретируемый гипофизом. Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной карликовости. Если вводить соматотропин в дозах 10 мг на кг веса три раза в неделю, то за год ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см. Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа: 4 - 6 мг соматотропина в пересчете на конечный фармацевтический препарат. Таким образом, доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон, получаемый этим способом, был неоднороден и мог содержать медленно развивающиеся вирусы. Компания "Genentec" в 1980 году разработала технологию производства соматотропина с помощью бактерий, который был лишен перечисленных недостатков. В 1982 году гормон роста человека был получен в культуре E. coli и животных клеток в институте Пастера во Франции, а с 1984 года начато промышленное производство инсулина и в СССР. При производстве интерферона используют как E. coli, S. cerevisae (дрожжи), так и культуру фибробластов или трансформированных лейкоцитов. Аналогичными методами получают также безопасные и дешевые вакцины. На технологии рекомбинантных ДНК основано получение высокоспецифичных ДНК-зондов, с помощью которых изучают экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями (например, у человека и курицы). ДНК-зонды также используются в диагностике различных заболеваний. Технология рекомбинантных ДНК сделала возможным нетрадиционный подход "белок-ген", получивший название "обратная генетика". При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку. Если он экспрессируется, несущая его клетка и ее потомки будут синтезировать измененный белок. Таким образом можно исправлять дефектные гены и лечить наследственные заболевания. Если гибридную ДНК ввести в оплодотворенное яйцеклетку, могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие мутантный ген и передающие его потомками. Генетическая трансформация животных позволяет установить роль отдельных генов и их белковых продуктов как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах. С помощью генетической инженерии созданы линии животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с полезными для человека признаками. Например, микроинъекция рекомбинантной ДНК, содержавшей ген соматотропина быка в зиготу кролика позволила получить трансгенное животное с гиперпродукцией этого гормона. Полученные животные обладали ярко выраженной акромегалией. Сейчас даже трудно предсказать все возможности, которые будут реализованы в ближайшие несколько десятков лет. Читать дальше ► методы генной инженерии Другие главы раздела: Ферменты, используемые в генетической инженерии Классификация, номенклатура и характеристика рестриктаз Построение рестрикционных карт Конструирование рекомбинантных ДНК Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК Гибридизация как высокочувствительный метод выявления специфических последовательностей нуклеотидов Методы клонирования ДНК Введение гена в клетку Генетические манипуляции с бактериальными клетками Введение генов в клетки млекопитающих Генная инженерия растений Литература к разделу Реклама

© 1995-2010 Наталья Кузьмина

Методы генной инженерии

Генетическая инженерия - конструирование invitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе - создание искусственных генетических программ (Баев А. А.). По Э. С. Пирузян генетическая инженерия - система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных или гибридных молекул ДНК.

Генетическая инженерия - получение новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в этом организме и у его потомства. Речь идет о направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата рецепиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства.

Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека. Например, получение «биологических реакторов» - микроорганизмов, растений и животных, продуцирующих фармакологически значимые для человека вещества, создание сортов растений и пород животных с определёнными ценными для человека признаками. Методы генной инженерии позволяют провести генетическую паспортизацию,  диагностировать генетические заболевания,  создавать  ДНК-вакцины, проводить генотерапию различных заболеваний.

Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:

• специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;

• быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;

• конструирование рекомбинантной ДНК;

• гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью, основанную на их способности связывать комплементарные последовательности нуклеиновых кислот;

• клонирование ДНК: амплификация invitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;

• введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.

История генной инженерии

Генная инженерия появилась благодаря работам многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики. На протяжении многих лет главным классом макромолекул считали белки. Существовало даже предположение, что гены имеют белковую природу. Лишь в 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что носителем наследственной информации является ДНК. С этого времени начинается интенсивное изучение нуклеиновых кислот. Спустя десятилетие, в 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК. Именно этот год принято считать годом рождения молекулярной биологии.

На рубеже 50 - 60-х годов были выяснены свойства генетического кода, а к концу 60-х годов его универсальность была подтверждена экспериментально. Шло интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой стали E. coli, ее вирусы и плазмиды. Были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул ДНК, плазмид и вирусов. ДНК вирусов и плазмид вводили в клетки в биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и экспрессию соответствующих генов. В 70-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения ДНК. Особая роль в развитии методов генной инженерии принадлежит рестриктазам и ДНК-лигазам.

Историю развития генетической инженерии можно условно разделить на три этапа.

Первый этап связан с доказательством принципиальной возможности получения рекомбинантных молекул ДНК invitro. Эти работы касаются получения гибридов между различнымиплазмидами. Была доказана возможность создания рекомбинантных молекул с использованием исходных молекул ДНК из различных видов и штаммов бактерий, их жизнеспособность, стабильность и функционирование.

Второй этап связан с началом работ по получению рекомбинантных молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности.

Третий этап - начало работ по включению в векторные молекулы ДНК (ДНК, используемые для переноса генов и способные встраиваться в генетический аппарат клетки-рецепиента) генов эукариот, главным образом, животных.

Формально датой рождения генетической инженерии следует считать 1972 год, когда в Стенфордском университете П. Берг, С. Коэн, Х. Бойер с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, содержавшую фрагменты ДНК вируса SV40, бактериофага и E. coli.

Читать дальше ► ферменты для манипуляций с ДНК и РНК

Генетическая инженерия - потомок молекулярной генетики, но своим рождением обязана успехам генетической энзимологии и химии нуклеиновых кислот, так как инструментами молекулярного манипулирования являются ферменты. Если с клетками и клеточными органеллами мы подчас можем работать микроманипуляторами, то никакие, даже самые мелкие микрохирургические инструменты не помогут при работе с макромолекулами ДНК и РНК. Что же делать? В роли "скальпеля", "ножниц" и "ниток для сшивания" выступают ферменты.

Только они могут найти определенные последовательности нуклеотидов, "разрезать" там молекулу или, наоборот, "заштопать" дырку в цепи ДНК. Эти ферменты издавна работают в клетке, выполняя работы по репликации (удвоению) ДНК при делении клетки, репарации повреждений (восстановлению целостности молекулы), в процессах считывания и переноса генетической информации из клетки в клетку или в пределах клетки. Задача генного инженера - подобрать фермент, который выполнил бы поставленные задачи, то есть смог бы работать с определенным участком нуклеиновой кислоты.

Следует отметить, что ферменты, применяемые в генной инженерии, лишены видовой специфичности, поэтому экспериментатор может сочетать в единое целое фрагменты ДНК любого происхождения в избранной им последовательности. Это позволяет генной инженерии преодолевать установленные природой видовые барьеры и осуществлять межвидовое скрещивание.

Ферменты, применяемые при конструировании рекомбинантных ДНК, можно разделить на несколько групп:

- ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы);

- ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы);

- ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);

- ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК.