Особенности определения возраста рыб по костям и отолитам
Кости и отолиты для определения возраста употребляются в следующих случаях:
при определении возраста рыбы, у которой отсутствует чешуя (осетровые);
чешуя не пригодна для определения возраста (пеламида);
определение возраста по чешуе не разработано и требуется материал для проверки и уточнения.
Для определения возраста рыб можно использовать кости жаберных крышек, кости плечевого пояса, челюстные кости, кости черепа, позвонки, жесткие лучи плавников, отолиты, глоточные зубы и т.д.
По данным В.В. Кондюрина (1974), определение возраста у акул представляет большую трудность. Если у костистых рыб возраст можно определять по чешуе, костям и отолитам, то у пластинчатожаберных ни один из этих элементов не может быть использован.
Исключение составляют колючие акулы, у которых качественное и быстрое определение возраста возможно по шипам спинных плавников (рис. 17).
Рис. 17. Шипы 2-го спинного плавника различной степени изношенности
(вид спереди)
Существуют несколько различных методов определения возраста на шипах: по внешним признакам – темным косым полосам на поверхностном эмалевом слое спинных шипов, на установлении корреляционных связей между длиной шипа от границы эмалевого слоя у его основания до верхнего конца шипа, приростами шипа за каждый год, шириной шипа у основания эмалевого слоя и длиной шипа.
По мере роста акул верхняя часть шипа стирается, что при определении возраста искажает результаты, однако установлено, что ширина и длина шипа находятся в прямолинейной зависимости, что позволяет построить кривую и определить теоретически возможную зависимость абсолютной длины шипа от длины рыбы.
Методика определения возраста осетровых по срезам костного луча грудного плавника разработана Н.Л. Чугуновым (1926), затем эту методику стали применять для определения возраста карповых, сома, щуки и других рыб.
Н.И. Чугунова (1961) предложила делать срез толщиной 0,5 мм; слишком тонкие (0,3 мм) и слишком толстые срезы не пригодны для определения возраста. Срезы лучей различных осетров не одинаковы: срезы лучей севрюги имеют округлые края, слабо вытянутые боковые лопасти с малым количеством добавочных слоев. Срезы лучей осетров – угловатые очертания годовых колец, довольно часто разрушенную зону первого года, много дополнительных колец, часто годовые кольца сдвоены с добавочными, при этом добавочных центров немного (рис. 18).
Рис. 18. Срез луча шипа
Срезы лучей молодой белуги похожи на срезы лучей севрюги, годовые слои довольно четки. Срезы лучей крупных белуг менее четки, центр среза, как правило, разрушен, иногда хорошие результаты получаются при распиле мягких лучей плавников.
Э.В. Макаров (1970) считает, что годовое кольцо образуется в результате периодической (зимней) задержки роста рыбы и ее луча.
Образование зимних колец на спилах не всегда приурочено к календарному году.
Осенью (в сентябре-ноябре) у осетровых всех возрастных групп не наблюдается зимнего кольца, оно появляется в мае-июне.
Образование зоны сближенных колец в преднерестовый период связано с замедленным ростом рыбы.
Рыб, имеющих одну зону сближенных колец, относят ко впервые нерестующим рыбам, с двумя зонами сближенных колец – к вторично нерестующим, с тремя – нерестующим в третий раз.
Число сближенных колец в нерестовых марках осетровых колеблется от двух до десяти, чаще всего их пять-семь (у осетра и белуги) и четыре-шесть (у донской севрюги).
У самцов количество сближенных колец в нерестовых марках меньше, чем у самок.
Нерестовая марка на спилах луча у большинства рыб выражена довольно четко (рис.19).
Рис. 19. Срез луча шипа с нерестовой отметкой (отмечено стрелками)
Для определения возраста леща по срезам лучей у свежей рыбы вырезается грудной или спинной плавник вместе с сочленованными головками лучей (Веткасов, 1970). Лучшим материалом для определения возраста оказался спинной плавник, но при этом портился товарный вид рыбы, поэтому приходилось брать грудной плавник.
У мелких рыб размерами менее 20 см вырезался весь спинной плавник, у более крупных использовались только 5-6 первых лучей этого плавника. Грудной плавник, как правило, брался полностью у всех рыб (рис. 20, 21).
Собранные плавники помещались вместе с чешуей в чешуйные книжки. Плавники закладывались лучами в книжку, а сочленованными головками наружу. Такая закладка обеспечивала более быстрое высыхание тканей. Просушивались книжки в помещении при хорошей вентиляции. После просушки лучи и чешуя разделялись по бумажным пакетам, на которые выписывались все данные с чешуйной книжки. Пакеты разбирались по размерным группам и устанавливались в картотеку.
Рис. 20. Срез первых трех лучей спинного плавника леща (возраст 14+)
Рис. 21. Срез лучей спинного плавника леща (возраст 11+)
Просушенные плавники леща размером более 20 см распиливались без всякой предварительной подготовки электролобзиком типа ЛН-1 с пилками по металлу №1. Сначала отпиливались сочленованные головки вместе с суставной частью луча, а затем делалось до 5 срезов толщиной 0,5-0,8 мм, так чтобы плоскости срезов были перпендикулярны к оси луча. Чтобы избежать выклинивания первого годового кольца, срезы делались у самой сочленованной головки не далее 1 см от нее. Первые один-два среза часто были не прозрачными. На всех следующих срезах годовые кольца просматривались одинаково хорошо даже без шлифовки. Для лучшего чтения годовых колец срезы шлифовались на наждачной бумаге № 0.00.000. Толщина их доводилась до 0,3-0,5 мм, чем достигалась наиболее четкая видимость годовых колец.
Лучи мелких рыб без предварительной подготовки распиливать не представляется возможным, так как они крошатся под пилкой лобзика. Чтобы устранить этот недостаток, рекомендовано заливать лучи мелких рыб полистиролом, растворенным в бензоле. Этот раствор дает достаточно толстое покрытие, прозрачен и позволяет в случае необходимости увеличивать толщину покрытия, после кратковременной сушки. Полистирол растворяется до консистенции жидкого теста, в этот состав плавники опускаются или обмазываются им. Через одну-две минуты полистирол затвердевает и плавники можно ставить на просушку или увеличивать толщину слоя покрытия вторичным обмазыванием.
Для просушивания плавники приклеивались полистиролом к пакетам, в которых лежали раньше. Пакеты ставились вертикально в какую-либо стойку. Полностью полистирол затвердевал через 4-5 часов, но практически сушка происходила дольше, так как плавники, приготовленные в течение рабочего дня, оставлялись до следующего утра. После просушки плавники легко отделялись от пакетов и складывались в них для последующего хранения или сразу распиливались.
Плавники у рыб длиной 15-20 см распиливались электролобзиком. Для более мелких рыб этот инструмент оказался слишком грубым, для них использовалось лезвие безопасной бритвы, вставленное в оправу. Предварительно лезвие опускалось на пламени газовой горелки, на нем другим лезвием, ножом или иглой наносилась зубчатая насечка и лезвие снова закаливалось. Плавник укладывался на деревянную или пенопластовую пластинку, крепко прижимался к ней пальцами левой руки и распиливался. Срезы мелких плавников требовали незначительной шлифовки на самой тонкой наждачной бумаге.
Определение возраста проводится с помощью микроскопа МБС-1 при увеличении от 26,5 до 56 раз. Никаких просветляющих средств при этом не применялось. Годовые кольца отчетливо просматривались в проходящем свете, как резко очерченные светлые замкнутые линии. Наиболее трудно определялось первое годовое кольцо. Центр луча часто был сплошь светлым без темной зоны роста. Вероятно, это объясняется тем, что в первый год жизни лучи плавников имеют очень незначительную толщину. Последующие годовые кольца были ясно выражены и легче просчитывались. На срезах луча спинного плавника кольца имеют подковообразную форму и резко выражены (рис. 22).
Рис. 22. Срез жесткого луча спинного плавника сазана
Наиболее удобен для чтения третий жесткий луч спинного плавника, так самый крупный (рис. 23). На грудных плавниках форма годовых колец более сложная и возраст по ним определяется труднее. Добавочных колец на срезах лучей не обнаруживается, нет на них также мальковых и нерестовых.
Рис. 23. Спил третьего жесткого луча спинного плавника сазана (9+)
На чешуе рыб старше 10 лет последние годовые кольца практически просчитать невозможно, тогда как на срезах лучей они читаются легко до возраста 15+-17+ лет.
У окуневых возраст можно определять по крышечным костям, срезам колючих лучей спинного и анального плавников (рис. 24) (Пермитин, 1963).
Рис. 24. Спилы анальных плавников и чешуй окуня разных возрастов
Анальный луч вырезался вместе с суставной сумкой и закладывался в чешуйную книжку. После просушки, продолжающейся 10-14 дней, можно приступать к распиливанию. Срез нужно сделать с таким расчетом, чтобы захватить годовой прирост первого года. Лучи распиливают обычным лобзиком с тонкой пилкой №00. Толщина спила не должна превышать 0,5-0,7 мм, очень тонкий спил покрывается трещинами, слишком прозрачен и годовые кольца на нем не заметны. Полученный спил не нуждается в обработке и его можно сразу просматривать под бинокуляром.
Спил просветляют трансформаторным маслом. Значительно лучше просматривать спилы при комбинированном освещении дневным и электрическим светом с применением светофильтра. При таком освещении годовые кольца выделяются отчетливее.
Согласно А.Г. Смирнову (1929), жаберные крышки, очищенные от тканей, слизи и омыленных жиров, 10-15 мин выдерживают в глицерине, а затем в нем же в широкой стеклянной пробирке нагревают до кипения (290 С). В кипящем глицерине кости из прозрачных становятся молочно-белого цвета и на этом фоне годовые кольца начинают отчетливо выделяться. Первое годовое кольцо, которое проходит недалеко от суставной сумки, где кость толще, появляется несколько позднее. Если крышку задержать в кипящем глицерине, она пожелтеет и структура годовых колец будет иной.
Крышечные кости в целом дают более четкую картину, но первые два кольца, как правило, определить очень трудно и здесь возможна ошибка (рис. 25).
Рис. 25. Жаберная крышка: 1 – обработана обычным способом;
2 – выдержана в кипящем глицерине
Определение возраста сома, как рыбы не имеющей чешуи, проводится по костям, шлифам лучей грудного плавника и первому туловищному позвонку (Дронов, 1976). Первый туловищный (сложный, или комплексный) позвонок распиливался в дорзовентральном направлении. Определение возраста проводилось в нескольких направлениях: по сочленованной поверхности (передней и задней), по внутренним конусовидным полостям тела позвонка и по поперечным сочленованным поверхностям (рис. 26).
Рис. 26. Схема распиливания первого туловищного позвонка сома
При необходимости для лучшей видимости эти поверхности подшлифовывались «бархатным» напильником или надфилем, а внутренние полости смачивались ксилолом для удаления жира. Препараты просматривались в отраженном свете под бинокуляром МБС-1 при малом увеличении. По этим препаратам можно производить и расчисление темпа роста.
Маргинальный (крайний) луч грудного плавника довольно легко извлекается и высушивается. Для получения шлифа он распиливается в поперечном направлении в непосредственной близости от сочленованной головки. Шлиф, имеющий толщину 0,5-0,6 мм, просветлялся ксилолом и рассматривался под бинокуляром. В большинстве случаев шлифовки не требовалось.
Однако определенную трудность в определении возраста сома по шлифам представляет степень резорбции центра луча, от которого может теряться одно, а иногда два возрастных кольца. Аналогичная картина отмечается и для осетровых. Поэтому, чтобы убедиться в правильности определения возраста сома, надо свериться с определением по позвонкам, особенно у старшевозрастных рыб. Наиболее четко годовые кольца видны в переднем и боковых секторах луча (рис. 27, 28), на лопастях луча видимость колец значительно хуже из-за сильного окостенения, особенно у старшевозрастных особей.
Рис. 27. Схема спила луча грудного плавника сома
Рис. 28. Спил луча грудного плавника сома
Определение возраста по позвонкам. П.Н. Кочкин (1980) предлагает следующий способ подготовки позвонков трески и минтая для определения возраста. Очищенную от мышц часть позвоночника кипятят в воде 2-3 мин. После этого позвонки легко отделяются друг от друга и с поверхности их сочленованных ямок пинцетом удаляют соединительную ткань и хрящи. Затем два-три очищенных позвонка вновь кипятят в воде 3-5 мин. Для плохо очищенных крупных позвонков эту операцию повторяют 2-3 раза и за это время удаляется вывариваемый из позвонков жир.
Для слабо обызвествленных позвонков антарктических рыб этого времени достаточно для их размягчения, структура позвонков при этом не нарушается. Для позвонков рыб, имеющих повышенное содержание кальция, желаемый результат можно получить при кипячении их под давлением в автоклаве, при этом срок выдерживания их в автоклаве для каждого вида рыб различен. Так размягчение позвонков трески без нарушения их структуры достигается при кипячении под давлением 1,5 атм. при t°С 127°С±3°С в течение часа, морского окуня и минтая – в течение 40 мин, а полосатой белокровной щуки – 7 мин.
После этой операции с наружной стороны размягченного позвонка лезвием отделяют все отростки и соединительную ткань, а позвонок разрезают продольно пополам. Края каждой половинки осторожно обрезают с постепенным углублением лезвия к центру позвонка. Полученная заготовка имеет вид двух соединенных вершинами конусов с нечеткой структурой. Структура позвонка становится более четкой при окрашивании. Наилучшие результаты получены при использовании методики окрашивания на белок.
Лучшая видимость структуры позвонков достигается при просмотре препаратов под бинокуляром в падающем поляризованном свете с использованием поляризационных фильтров ПФ-42, при этом один светофильтр крепят к объективу бинокуляра, а другой помещают над препаратом.
По данным зарубежных исследователей (A.G. Johnson, 1979; Munekiyo Masahiro et all, 1982) с позвонков от свежих, замороженных или фиксированных формалином костистых рыб удаляют желеобразное вещество, для чего их смачивают гипохлоридом натрия, затем погружают в 0,01 % раствор кристаллвиолета в дистиллированной воде на 0,2-0,4 ч в зависимости от размера позвонка, после чего промывают в воде. Нефиксированные крупные позвонки после окраски можно обработать 5%-ным формалином. Перекрашенные позвонки осветляют в 50%-ном водном растворе пропанола, после окраски центры позвонков имеют красный цвет с хорошо выраженными кольцами. Другая пригодная краска – ализарин красный в концентрации – 0,32%.
Метод подготовки заключается в том, что очищенный от ткани и обезжиренный позвонок покрывают поливинилспиртом, который образует пленку, точно копирующую структуру поверхности тела позвонка. Застывшую пленку отделяют от позвонка и просматривают под микроскопом. Метод применялся к двум видам рыб: сериоле и ставриде, определение возраста которых по отолитам и костям жаберной крышки затруднено.
Отолиты как наиболее надежная регистрирующая структура широко применяется для определения возраста рыб. Однако закономерности их роста, особенно количественные, изучены на сегодня недостаточно, что существенно снижает сферу их использования. Эффективным способом получения количественных характеристик элементов структуры отолита является метод микрофотометрирования негативных изображений, разработанный М.В. Миной (1965) при изучении отолитов трески (рис. 29, 30).
Рис. 29. Шлиф отолита трески (а) и кривая-характеристика (б) (1+)
Рис. 30. Шлиф отолита трески (а) и кривая-характеристика (б) (6+)
Существуют две основные причины, обуславливающие непригодность отолитов для определения возраста. Первая причина – полное или частичное перерождение (кристаллическое) одного или обоих отолитов, вторая – асимметричность отолитов одной пары, которые могут различаться как по своим размерам, так и по числу зон роста. Следует отметить, что явление кристаллического перерождения и асимметричности отолитов относительно редки (например, у балтийского шпрота соответственно 3 из 100 и 1 из 1000), поэтому с практической точки зрения сам метод определения возраста рыб по отолитам под сомнение не ставится.
По оптической плотности субстанции отолитов различают менее прозрачные – опаковые и более прозрачные – гиалиновые зоны. Возникновение зональности в строении отолитов связывается с сезонной неравномерностью роста рыб.
Известно, что неорганическое вещество отолитов состоит из CaCO2 в форме игольчатых кристаллов арагонита, органическое вещество представляет собой – уникальный по аминокислотному составу фиброзный белок – отолин, близкий к конхиолину – белку раковин некоторых моллюсков. Наблюдаемые различия в оптической плотности субстанции отолитов, видимо, связаны с различным соотношением органического и неорганического компонентов в опаковых и гиалиновых зонах. Показано, что гиалиновые зоны содержат больше органического вещества, чем опаковые. Существуют разные мнения о том, какой компонент отолитов органический или минеральный более прозрачен для видимого света. Целесообразно зоны роста отолитов, соответствующие летнему быстрому росту, считать опаковыми (менее прозрачными); зимнему медленному росту, задержке роста – гиалиновые (прозрачные) (Апс, 1982).
Отолиты, как правило, надо брать у свежей рыбы, при этом следует помнить, что у рыб, хранившихся в формалине, отолиты становятся хрупкими и теряют прозрачность.
У мелких рыб (хамса, шпрот) после 2-3 месячного хранения в формалине отолит полностью растворяется, однако не всегда консервирующие жидкости губительно действуют на отолиты. Например, отолиты невской корюшки хорошо просматриваются у рыб, фиксированных формалином или спиртом, причем просвечиваемость годовых колец не ухудшается.
Когда нельзя вынуть отолиты у только что пойманных мелких рыб, их помещают в слабый раствор формалина (2-3%) на один-два дня, но при первой же возможности их необходимо вынуть и обработать. Через неделю хранения рыб в формалине отолиты становятся хрупкими и непригодными для определения возраста.
Мелкие прозрачные отолиты рассматривают без всякой предварительной обработки, помещая их в просветляющие жидкости (у хамсы, шпрота, ставриды, невской корюшки, иногда судака, у которого отолиты довольно крупные и прозрачные).
Иногда отолиты перед просмотром прокаливают в пламени спиртовки, подшлифовывают.
Крупные отолиты (трески) перед шлифовкой разламывают посредине на две части, поверхность слома прокаливают в пламени спиртовки, после чего она желтеет, годовые кольца проступают резче. Затем обе половинки укрепляют либо в воске, либо в пластилине так, чтобы поверхность слома была обращена кверху, и рассматривают в падающем свете, пользуясь просветляющими жидкостями.
В некоторых случаях применяют более сложные методы обработки отолитов. Отолиты беломорской корюшки, налима выдерживают, прежде всего, в нашатырном спирте (25% растворе аммиака) от 30 мин до 3-х суток после этого их промывают в горячей воде и рассматривают по бинокуляром в капле глицерина. Если кольца плохо видны, то отолиты помещают на 3-5 мин в кипящий раствор поваренной соли (6 г соли на 100 см3 воды) и снова промывают в горячей воде.
Если и после такой обработки отолитов годовые кольца на них видны неотчетливо, их дополнительно шлифуют. Для этого отолит распиливают лобзиком перпендикулярно к продольной оси или стачивают напильником, а потом шлифуют на оселке. Затем отолит заливают в канифоль на предметном стекле так, чтобы отшлифованная поверхность была обращена к стеклу. Когда канифоль затвердеет, отолит стачивают напильником до тонкой пластинки, затем ее шлифуют до полной просвечиваемости, канифоль растворяют ксилолом, заливают канадским бальзамом и покрывают покровным стеклом.
Помимо годовых колец на отолитах бывают видны и добавочные кольца, но они менее резки и большей частью не замкнуты.
При определении возраста балтийского шпрота по отолитам, последние берутся от свежей или зафиксированной в этаноле рыбы (Апс, 1982). Отолиты шпрота, зафиксированного в формалине, не пригодны для определения возраста. Отолиты помещаются в ксилол, толуол или глицерин и просматриваются в отраженном свете на черном фоне с небольшим увеличением (рис. 31 А).
Можно залить отолиты канадским бальзамом и рассматривать под микроскопом в проходящем свете. Для определения возраста достаточно 100-кратного увеличения и лишь для определения возраста отдельных старшевозрастных рыб необходимо увеличение до 250 раз. Хорошие результаты дает применение поляризованного света, определение возраста балтийского шпрота состоит в распознавании и подсчете более широких летних опаковых и более узких зимних гиалиновых зон. Летние опаковые зоны могут заключать в себе одну или несколько узких гиалиновых подзон внутрисезонных задержек роста, не учитываемых при определении возраста. Возрастная структура балтийского шпрота характеризуется обычно доминированием одной какой-нибудь возрастной группы и постоянным наличием в ней рыб старших возрастов.
При использовании электронного микроскопа на отолитах шпрота можно определить суточные приросты и факторы, влияющие на рост (например, выявить среднюю температуру воды, в которой обитала рыба и ее миграционные тенденции) (рис. 31 Б).
Рис. 31. Отолит балтийского шпрота в обычном проходящем свете (А) и
в проходящем поляризованном свете (Б)
При использовании чешуи для определения возраста гольца, возраст оказывается заниженным на 1-4 года, чаще на два года (Тиллер, 1986). Использование же отолитов дает более надежный результат, однако и здесь возможно занижение возраста за счет первого годового кольца. Первое годовое кольцо обычно плохо очерчено, расплывчато, с трудом поддается измерению, видимо, его принимают за ядро отолита, а первым годом уже считают второе годовое кольцо, которое имеет четкие границы (рис. 32).
Рис. 32. Отолит гольца в возрасте 5+
(стрелкой показано первое годовое кольцо)
Определение возраста хариуса по чешуе и отолитам по данным М.Б. Скопеца и др. (1990) показало существенное занижение продолжительности жизни у старшевозрастных рыб (старше 1-11 лет). Это явление ранее отмечалось у хариусов Аляски. На чешуе старых особей годовые приросты, как правило, незаметны (рис. 33).
Рис. 33. Чешуя и отолит камчатского хариуса из р. Еропол:
а – чешуя, возраст 13+ лет, проходящий свет;
б – отолит, возраст 17+ лет, отраженный свет
Для определения возраста у карповых рыб чаще используется чешуя, спилы лучей и кости, чем отолиты. Хотя в литературе есть сообщения о вполне успешном их применении у уклеи, линя, ельца и др.
М.В. Мина (1989) использовал отолиты для определения возраста у ельца. Отолит ельца имеет форму, характерную для представителей семейства карповых (рис. 34). В передней части его имеется мощный выступ, задняя часть его уплощена.
Рис. 34. Отолит sagitta представителя семейства карповых (схема)
Извлеченные отолиты помещают в глицерин. Уже через несколько минут в задней части отолита начинают проступать чередующиеся опаковые и гиалиновые зоны, они лучше всего видны при рассмотрении антимакулярной поверхности (обращенной от мозга) на темном фоне в падающем свете.
Первая по времени образования гиалиновая зона располагается так, что ее центр значительно смещен к переднему краю отолита, и у крупных особей она оказывается в той или иной мере скрытой под выступом на антимакулярной поверхности. На отолитах крупных особей первая зона становится видна только через несколько дней нахождения в глицерине (рис. 35).
Рис. 35. Отолит ельца из Верхне-Рузского водохранилища, l – 181 мм. Шесть гиалиновых зон
Число гиалиновых зон на отолите и наиболее четких колец на чешуе оценивалось независимым оператором дважды через три месяца. Расхождения в оценках независимых определений по чешуе отмечены в 9 случаях из 52 (в одном случае – на 2, в восьми – на 1 год), т.е. совпадение оценок составило 83%, расхождения оценок по отолитам не превышали одного года и были отмечены в 11 случаях из 53 (совпадение 79%).
Несоответствия оценок возникают, как правило, у особей, имеющих более 4-х гиалиновых зон на отолитах, причем при определении возраста по чешуе у этих рыб оценки, как правило, были заниженными.
У наиболее крупных ельцов бывают плохо различимы периферийные зоны отолитов и, кроме того, возникают сомнения относительно положения первой гиалиновой зоны, скрытой под выступом на антимакулярной поверхности отолита. Чтобы зоны выявились более четко, было достаточно, прокалить отолит целиком в пламени спиртовки и затем снова просветлить его в глицерине. В других случаях изготовлялся и обжигался аншлиф, для чего отолит ставили на ребро в каплю расплавленного парафина на предметном стекле и после того, как парафин застывал, шлифовали на корундовом бруске со шлифовальным порошком, добиваясь, чтобы срез прошел через середину отолита в плоскости, обозначенной на рис. 34 по линии аа.
Контрольные вопросы и задания
Морфология чешуи, костей, отолитов.
Способы подготовки чешуи, костей, отолитов к определению возраста.
Особенности определения возраста по чешуе, костям, отолитам.
Способы расчисления темпа роста у рыб (Э. Леа, Жакову и Меншуткину и др.).
Феномен Розы Ли.