Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Саратовский государственный медицинский университет

имени В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения и социального

развития Российской Федерации

(ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России)

«Утверждаю»

Зав. кафедрой микробиологии,

вирусологии и иммунологии

профессор Г.М. Шуб

«___» __ ____________ 2012г.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

к практическому занятию

для студентов __2_ курса

по специальности лечебное дело

Тема: Учение об инфекции. Факторы вирулентности

и методы их определения.

Саратов 2012

1. Тема: Учение об инфекции. Факторы вирулентности и методы их определения.

2. Место проведения: кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии

3. Продолжительность: 135 мин: из них самостоятельная аудиторная работа 80 мин.

3. Цель занятия: Ознакомиться с основополагающими моментами учения об инфекции – факторами, участвующими в развитии инфекции, классификацией микроорганизмов по способности вызывать инфекцию, со свойствами, определяющими эту способность.

4. Мотивационная характеристика занятия: патогенный потенциал многих возбудителей зависит как от свойств, присущих конкретному микроорганизму, так и от состояния факторов защиты хозяина. Сложные процессы взаимодействия между патогенными микроорганизмами и продуктами их жизнедеятельности с одной стороны, тканями, органами, клетками организма хозяина с другой, определяют особенности течения инфекционного процесса и его эпидемиологию. Все вышеизложенное диктует необходимость изучения различных факторов вирулентности бактерий.

В результате занятия

1. Студент должен знать: определения: «инфекция, инфекционное заболевание», классификации инфекционных болезней, понятия патогенности и вирулентности микроорганизмов, методы определения вирулентности и ее количественную оценку,.

2. Студент должен уметь определять факторы вирулентности культур микроорганизмов, в частности наличие капсул, ферментов агрессии и защиты, токсинов.

3. Студент должен ознакомиться с методами изучения вирулентности на лабораторных животных, а также с методическими рекомендациями, таблицами, демонстрационным материалом.

5. Таблицы по данной теме:

• Токсины бактерий.

• Классификация инфекций.

• Формы лечения инфекционных болезней.

• Пути передачи инфекций.

• Факторы вирулентности.

Учебные элементы:

• Составляющие инфекции: патогенный микроорганизм, восприимчивый макроорганизм, окружающая среда.

• Классификация инфекционных болезней.

• Факторы вирулентности микроорганизмов и их методы определения.

• Классификация инфекционных болезней по эпидемическому принципу, биологической природе возбудителя, по числу возбудителей, характеру течения, происхождению возбудителя, по резервуару возбудителя, локализации инфекционного процесса, по распространенности.

• Механизмы, пути и факторы передачи инфекции.

6. Контрольные вопросы для подготовки к занятию:

• Определение понятий «инфекция, инфекционная болезнь».

• Варианты течения инфекционного процесса (суперинфекция, реинфекция, смешанная, вторичная инфекция, обострение, рецидив).

• Периоды инфекционного заболевания.

• Определение вирулентности и патогенности, провести их сравнительную характеристику.

• Факторы вирулентности бактерий и единицы ее измерения.

• Методы определения некоторых факторов вирулентности (адгезинов, факторов агрессии и защиты, экзотоксинов)

7. Содержание самостоятельной работы студентов:

Виды самостоятельной работы:

• Выполнение тестового задания по теме.

• Учет наличия факторов вирулентности у стафилококков (плазмокоагулаза, лецитиназа, гиалуронидазы, гемолизины).

• Выявление капсулы у бактерий.

• Ознакомление с методами определения вирулентности микроорганизмов по величине летальной дозы.

Вид деятельности	Пояснения к самостоятельной работе
	Демонстрация роста стафилококка с лецитиназной активностью на среде ЖСА, гемолитического стафилококка на кровяном агаре, гиалуронидазной, плазмокоагулазной, активности стафилококка (пробирки с цитратной кроличьей плазмой, гиалуроновой кислотой, 2N уксусной кислотой и взвесью стафилококков.
	Мазки препараты из культуры клебсиелл, окрашенные тушью по Бури-Гинсу

Алгоритм целевой деятельности студентов по выполнению заданий.

1. Определение плазмокоагулазной активности стафилококков.

Для постановки реакции плазмокоагуляции используют чистую культуру стафилококка, которую петлей вносят в пробирку, содержащую цитратную кроличью плазму. Результаты реакции регистрируют через 1час инкубации в термостате при 37°С. Появление на дне пробирки студнеобразного сгустка оценивают как положительный результат реакции. Отсутствие свертывания плазмы - как отрицательный результат. В качестве контроля используют пробирки: 1) плазма + культура стандартного штамма с плазмокоагулазной активностью («+К»), 2) плазма + культура стандартного штамма без плазмокоагулазной активности («- К»),

2. Оценку гемолитической активности проводят, используя чашки с питательным агаром, содержащим 5% отмытых физиологическим раствором эритроцитов (КА). Культуру стафилококка наносят на агар в виде бляшек. Продукцию гемолизина оценивают после инкубации в термостате через 18-24 часа по появлению зоны гемолиза. В случае, когда зона гемолиза отсутствовует, штамм расценивают как не обладающий гемолитической активностью.

3. Для определения лецитоветиллазы (лецитиназы) используют 1,8% питательный агар, содержащий 7,5 г NaCl на 100 мл среды и 1% яичного желтка. Одним из компонентов яичного желтка является лецитовителлин, который является субстратом для фермента лецитовитиллазы (лецитиназы), относящегося к группе липаз. Культуру стафилококкоа наносят мерной петлей на желточно-солевой агар. Посевы инкубируют в термостате в течение 48 часов при 37°С. О наличии лецитиназной активности свидетельствует наличие радужного венчика вокруг зоны роста. Отсутствие венчика свидетельствует о том, что данный штамм не вырабатывает соответствующий фермент.

4. Изучение гиалуронидазной активности культуры стафилококка. Смесь культуры и раствора гиалуроновой кислоты выдерживают в термостате при 37°С 15-20 мин, затем переносят на лед на 5 мин, после чего добавляют 1-2 капли 2N раствора уксусной кислоты. Раствор гиалуроновой кислоты (гиалуронат) дает в присутствии 2N уксусной кислоты типичный сгусток. При наличии гиалуронидазы образование сгустка не происходит, в связи с деполимеризацией гиалуроновой кислоты микробным ферментом. В качестве контроля используют пробирки: 1) гиалуроновая кислота + культура стандартного штамма с гиалуронидазной активностью + 2N уксусная кислота («+К»), 2) плазма + культура стандартного штамма без гиалуронидазной активности + 2N уксусная кислота («- К»),

5. Для выявления капсул у бактерий готовят препараты методом Бурри, окрашенные тушью по Гинсу. С этой целью на стекле взвесь капсульного микроба смешивают с тушью в соотношении 1:9 и готовят тонкий мазок, который высушивают на воздухе и окрашивают водным фуксином. В результате на темном фоне капсула выглядит в виде бесцветного ободка вокруг красного тела бактерий.

6. Вирулентность микроорганизмов определяют по величине летальной дозы. Ее определяют на лабораторных животных.

Летальная доза - это минимальное количество микроорганизмов или их токсинов, вызывающее в определнный срок гибель конкретного количества животных. Различают:

Dcl (dosis centa letalis) – минимальное количество микроорганизмов или их токсинов, вызывающее гибель 100% животных.

Dlm – – минимальное количество м/о, вызывающее гибель 90-98%

животных.

Ld 50 – минимальное количество м/о, вызывающее гибель – 50% животных.

Определение Dlm бульонной культуры пневмококка.

В ряд пробирок вносят по 1,8 мл физиологического раствора. Затем в первую пробирку вносят 0,2 мл суточной бульонной культуры пневмококка и перемешивают. Получается первое десятикратное разведение (10^-1). Затем из первой пробирки 0,2 мл переносят во вторую (разведение 10^-2) и т.д. до получения разведения равного 10^-9. После этого производят внутрибрюшинное заражение мышей 0,2 мл каждого разведения. С этой целью, удерживая животное в вертикальном положении головой вниз, вводят иглу в нижнюю часть живота. Оценивают число павших животных.

Вскрытие проводят сразу же после гибели животного, соблюдая правила асептики. Вскрытие производят стерильными инструментами. Для вскрытия грудной клетки производят поперечный разрез под мечевидным отростком и два продольных разреза через ребра параллельно грудине. Откидывают вырезанный лоскут и осматривают органы грудной полости. Из ткани легких делают мазки отпечатки и посевы на питательные среды. При микроскопии отмечают присутствие возбудителя в легочной ткани.