Глава 11. Биодеструкция ксенобиотиков и поллютантов. Контроль загрязнения окружающей среды

11.1. Биодеградация ксенобиотиков в окружающей среде

Распространение и поведение ксенобиотиков в окружающей среде. В настоящее время известно более 6 млн. индивидуальных химических соединений. Около 90% этих веществ имеют синтетическое происхождение, они появились в последние 50 лет. Ежегодно синтезируется около 200 тыс. новых соединений.

Большинство этих соединений являются чужеродными для многих организмов и экосистем в целом, т. е. являются ксенобиотиками. Закономерности структурно-функционального воздействия чужеродных веществ на живую природу стали предметом изучения новой области биологии – ксенобиологии. Ксенобиология рассматривает вопросы влияния ксенобиотиков на различных уровнях организации живых систем, механизмы биоаккумулирования и биотрансформации ксенобиотиков.

Наибольшее количество ксенобиотиков являются продукцией химической и фармацевтической промышленности (пластификаторы, красители, поверхностно-активные вещества (детергенты), взрывчатые вещества, пестициды, лекарственные препараты, консерванты и др.).

Попадание ксенобиотиков в окружающую среду привело к ее загрязнению.

Поначалу существовало убеждение, что природные сообщества микроорганизмов способны усваивать все органические соединения. Вследствие повсеместного присутствия микроорганизмов в окружающей среде и их высокого катаболического потенциала предполагалось, что любое соединение, попавшее в биосферу, будет полностью минерализовано.

Однако со временем был установлен факт накопления ксенобиотиков в окружающей среде и в живых организмах, и миф о «микробиологической надежности» был разрушен. Действие пестицидов в почве может проявляться годами. Так, остатки токсафена обнаружены в почве спустя 11 лет после применения, а дихлордифенилтрихлорэтан (ДДТ) сохраняется десятки лет. При этом он обладает способностью аккумулироваться в живых организмах, его концентрация в цепи: водная среда → фитопланктон → зоопланктон → мелкая рыба → крупная рыба → хищная птица увеличивается на 6–8 порядков.

Пестициды представляют наибольшую опасность для окружающей среды.

Во-первых, они применяются довольно широко и в больших количествах. Инсектициды используют для защиты растений от насекомых-вредителей, фунгициды – для борьбы с заболеваниями растений грибкового происхождения, гербициды – для уничтожения сорной растительности, альгициды – для защиты морских судов от обрастаний, для борьбы с зарастанием каналов и других водных систем.

Во-вторых, пестициды специально вносятся в окружающую среду, попадают в лито-, гидро- и атмосферу.

В-третьих, это соединения, обладающие биологической активностью. По данным Национальной академии наук США, 30% инсектицидов, 60% гербицидов и 90% фунгицидов являются канцерогенами разной степени, а >300 пестицидов, которые используются в сельском хозяйстве, способны вызывать мутации.

Особенностью пестицидов является то, что это разнообразные по химическому строению соединения: хлорсодержащие органические соединения, спирты, производные фенола, жирные кислоты и их производные, ароматические карбоновые кислоты, амины и соли четвертичных аммониевых оснований, гетероциклические соединения и др.

Поведение ксенобиотиков в окружающей среде обусловлено структурой и свойствами самих соединений и физико-химическими условиями среды. Может осуществляться их фотохимическое разложение и химическое окисление, гидролиз, связывание компонентами почвы и биодеградация.

Вклад микроорганизмов в процессы деградации различными авторами оценивается в 10–70%. Такая вариабельность показателей объясняется разнообразием структуры и свойств этих соединений.

Почва, как биологическая система, насыщена разнообразными микроорганизмами, которые в совокупности обладают широким набором ферментов, способных трансформировать органические вещества. Численность микроорганизмов в почве существенно варьирует в зависимости от почвенно-климатический условий, агротехнических мероприятий, качества растительного покрова. Биомасса их колеблется от нескольких сот килограммов до нескольких тонн на 1 га и составляет 0,01–0,4% от массы почвы.

Первым и наиболее простым доказательством участия микроорганизмов в разложении пестицидов является более высокая скорость деградации химических веществ в нестерильной почве по сравнению со стерильной.

Для процессов микробиологической деградации характерно наличие более или менее длительной лаг-фазы, в течение которой осуществляется адаптация популяции почвенных микроорганизмов к чужеродному химическому соединению.

Адаптация происходит, как правило, очень медленно. Тем не менее при многократном применении пестицидов установлено изменение микробного ценоза почвы в сторону возрастания в ней относительной доли микроорганизмов, способных разлагать эти вещества. Степень изменения зависит от химического состава препарата и условий жизнедеятельности микроорганизмов. Прекращение применения данного пестицида, как правило, приводит к быстрому сокращению микробиоты, способной к его деструкции.

Для разложения ксенобиотиков, уже находящихся в окружающей среде, на складах и полигонах, а также для детоксикации отходов различных производств и предотвращения дальнейшего загрязнения природы могут найти использование препараты микроорганизмов – активных деструкторов ксенобиотиков.

Получение микроорганизмов – деструкторов ксенобиотиков. Исследования по биодеградации ксенобиотиков почвенными микроорганизмами проводятся, начиная с середины 60-х гг. ХХ в.

Существует довольно много работ по выделению и культивированию микроорганизмов с «потенциалом биодеградации» ксенобиотиков. Авторы этих работ рассматривают методические аспекты и практические результаты выделения микроорганизмов, принципы культивирования, хранения и использования штаммов-деструкторов. Кроме того, важными направлениями исследований являются изучение физиологии и биохимии микробных культур, установление механизмов деструкции органических веществ в живой клетке.

На основании таких сведений можно обоснованно подбирать микроорганизмы, способные к биодеградации определенных соединений, а также определять соединения, которые могут быть разрушены определенными группами микроорганизмов.

В смешанных культурах микроорганизмов деструкция ксенобиотиков осуществляется более быстро и полно, поскольку имеет место комбинация катаболических возможностей отдельных представителей сообществ микроорганизмов. В результате этого достигается минерализация, недоступная чистым культурам микроорганизмов.

Для получения микроорганизмов – активных деструкторов ксенобиотиков – применяют селективные среды, содержащие данные ксенобиотики. Культуры микроорганизмов выделяют из образцов природных субстратов либо используют коллекционные штаммы, в том числе искусственные смеси таких штаммов.

Широкие возможности для отбора активных деструкторов имеет непрерывное культивирование в режиме возрастающих концентраций загрязнений. В таких условиях из исходных сообществ элиминируются микроорганизмы, имеющие невысокую скорость роста и недостаточный потенциал биодеградации данных загрязнений. В селекционированном сообществе преобладает от 2 до 10 видов микроорганизмов, обычно, бактерий, осуществляющих эффективное окисление загрязнений. Этот метод является основным в селекции микробных сообществ, предназначенных для биологической очистки сточных вод.

Разработан прием селекции, позволяющий получать ассоциацию микроорганизмов, не только эффективно ассимилирующую субстрат, но и сохраняющую жизнеспособность в течение длительного периода голодания. Прием основан на периодической смене типа питания в биореакторе: переход от избытка к недостатку субстрата. На первом этапе идет активное окисление загрязнений, а на втором – использование внутриклеточных резервных соединений, минерализация биомассы. Такая ассоциация будет стабильно функционировать при очистке производственных сточных водах непостоянного состава.

Воздействие мутагенными факторами в процессе отбора может привести к появлению мутантов с высокой деструктивной активностью.

Чтобы избежать вымывания активных деструкторов, имеющих невысокую скорость роста, при значительных скоростях протока в условиях непрерывного культивирования, проводят их закрепление (иммобилизацию) на носителях. Иммобилизация, кроме того, способствует защите клеток от субстратного ингибирования, вызываемого высокими концентрациями загрязнений.

Основную группу микроорганизмов, разрушающих ксенобиотики, составляют бактерии рода Pseudomonas. Разные штаммы бактерий этого рода способны расщеплять более 100 органических соединений, среди которых галогенпроизводные углеводородов, ароматические углеводороды, в том числе полиароматические, их галогенпроизводные и др. Часто один штамм использует в качестве источников углерода несколько родственных соединений. Кроме представителей рода Pseudomonas, активные деструкторы обнаружены среди бактерий родов Bacillus, Rhodococcus, Alcaligenes, Mycobacterium и др.

Cовременными методами получения активных деструкторов ксенобиотиков являются методы генетической рекомбинации и генной инженерии. К настоящему времени установлено, что гены, которые кодируют синтез ферментов, катализирующих деградацию пестицидов, могут быть локализованы в хромосомах, входят в состав крупных плазмид, а могут обнаруживаться и в хромосомной, и в плазмидной ДНК. В табл. 26 представлены описанные к настоящему времени природные плазмиды, встречающиеся у различных представителей почвенной микробиоты, и соединения, разрушение которых катализируют кодируемые этими плазмидами ферменты.

Таблица.26. Природные катаболические плазмиды

Плазмида	Деградируемое соединение	Микроорганизм-хозяин
SAL	Салицилат	Pseudomonas sp.
TOL	Толуол, ксилол	Pseudomonas putida
pJP1	2,4-Дихлорфенокси-уксусная кислота	Alcaligenes paradoxus
CAM	Камфора	Pseudomonas putida
XYL	Ксилол	Pseudomonas arvila
pAC25	3-Хлорбензоат, п-крезол	Pseudomonas putida
pWW17	Фенилацетат	Pseudomonas sp.
pUU204	Галогеналкилы	Pseudomonas sp.

Методами генетического конструирования в один штамм могут быть собраны плазмиды, кодирующие ферменты разных катаболических путей. Таким образом, из природных штаммов Pseudomonas putida, несущих катаболические плазмиды, каждая из которых кодирует фермент для расщепления одного класса соединений, был получен «суперштамм», способный осуществлять деградацию октана, гексана, декана, ксилола, толуола, камфоры, нафталина. Такая мультиплазмидная бактерия растет, утилизируя неочищенную нефть.

Расширить катаболические возможности микроорганизмов можно также путем модификации генов, кодирующих ферменты того или иного метаболического пути. Например, было установлено, что некоторые штаммы Pseudomonas putida, разлагающие ароматические соединения, такие как толуол, разрушают и трихлорэтилен. При этом для полной деградации трихлорэтилена не нужны все ферменты, участвующие в расщеплении толуола, достаточно лишь толуолдиоксигеназы, катализирующей одну стадию в окислении толуола. Синтез этого фермента кодируется четырьмя генами, которые выделили из Pseudomonas putida и экспрессировали в Escherichia coli. Скорость деградации трихлорэтилена у Escherichia coli ниже, чем у Pseudomonas putida, но она сохраняется дольше, что связывают с меньшей чувствительностью Escherichia coli к повреждающему действияю трихлорэтилена.

Одна из проблем практического применения модифицированных бактерий заключается в том, что они являются мезофилами, а в природных условиях температура обычно находится в интервале от 0 до 20С. Чтобы проверить возможность создания модифицированных психрофильных микроорганизмов плазмиду TOL, детерминирующую разложение толуола, мезофильного штамма Pseudomonas putida с помощью конъюгации перенесли в психрофильный штамм, утилизирующий салицилат. Трансформированный штамм содержал введенную в него плазмиду TOL и собственную плазмиду SAL и был способен утилизировать как салицилат, так и толуол в качестве единственного источника углерода при 0С. Этим экспериментом была показана возможность создания психрофильных деструкторов ксенобиотиков.

Однако о практическом применении генетически сконструированных штаммов пока говорить рано. Одна из основных проблем при конструировании микроорганизмов – сохранение стабильности новой катаболической функции, а следовательно, и самого штамма. Особенно это касается природной среды, где созданному микроорганизму приходится конкурировать с хорошо адаптированной к данным условиям естественной микробиотой, сталкиваться с разнообразием источников углерода, в том числе высокотоксичных.