3. Способы промышленного получения антибиотиков.
Химический синтез.
Биологический синтез.
Химическая или энзиматическая модификация.
- Генная инженерия.
В настоящее время установлена полная химическая структура только для трети антибиотиков, продуцируемых микроорганизмами, а химическим путем может быть получена лишь половина из них.
В связи с возросшей сложностью выделения эффективных антибиотиков и распространением устойчивости к наиболее широко применяемым соединениям у большого числа патогенных бактерий существует потребность в новых соединениях. Для этого исследователи перешли от поиска новых антибиотиков к модификации структуры уже имеющихся. Они стремятся повысить эффективность антибиотиков, найти защиту от инактивации ферментами устойчивых бактерий и улучшить фармакологические свойства препаратов. В некоторых случаях природные микробные антибиотические продукты химическим или энзиматическим путем могут быть превращены в так называемые полусинтетические антибиотики, обладающие более высокими терапевтическими свойствами.
При производстве вторичных метаболитов необходимо учитывать особенности культурального роста микроорганизмов. Например, в случае антибиотиков большинство микроорганизмов в процессе тропофазы чувствительно к собственным антибиотикам, однако во время идиофазы они становятся к ним устойчивыми. Чтобы уберечь микроорганизмы, продуцирующие антибиотики, от самоуничтожения, важно быстро достичь идиофазы и затем культивировать микроорганизмы в этой фазе. Это достигается путем варьирования режимов культивирования и составом питательной среды на стадиях быстрого и медленного роста.
Для максимального выхода антибиотика при культивировании продуцента необходим комплекс мер, включающий подбор питательных сред, высокопродуктивных штаммов микроорганизмов и режимов их культивирования.
Современное промышленное получение антибиотиков — это сложная многоступенчатая биотехнологическая схема, состоящая из ряда последовательных стадий:
направленный скрининг подходящего штамма микроорганизма;
стадия биосинтеза (образования) антибиотика — основная биологическая стадия процесса получения антибиотика: создание оптимальных условий для развития продуцента и максимально возможного биосинтеза антибиотика;
стадия предварительной обработки культуральной жидкости, клеток (мицелия) микроорганизма и фильтрации (отделение культуральной жидкости от биомассы продуцента). Определяется составом среды, характером роста продуцента, местом накопления биологически активного соединения (в культуральной жидкости или внутриклеточно);
стадия выделения и очистки антибиотика. В качестве основных методов применяют экстракцию, осаждение, сорбцию на ионообменных материалах, упаривание, сушку;
стадия получения готовой продукции, изготовления лекарственных форм, расфасовки.
Готовый продукт подвергается тщательному биологическому и фармакологическому контролю. Биологический контроль определяет степень стерильности препарата. В ходе фармакологического контроля проводят всесторонние испытания препарата на токсичность, пирогенность, токсикогенность и пр., устанавливают максимально переносимую дозу антибиотика, дозы, вызывающие полную и 50 % гибель экспериментальных животных. Готовая форма лекарственного препарата антибиотического вещества поступает к потребителю с указанием биологической активности и даты выпуска.
Пенициллин, исторически первый антибиотик, впервые выделил английский ученый А. Флеминг из плесневых грибов Penicillium notatum. В 1928 г. он обнаружил, что на агаре в одной из чашек Петри с бактериями Staphylococcus aureus выросла колония плесневых грибов. Колонии бактерий вокруг них стали прозрачными из-за разрушения клеток. Флемингу удалось выделить активное вещество — пенициллин, которое разрушало бактериальные клетки. Эта работа была опубликована в 1929 г. Флеминг недооценил свое открытие, считая, что получить лекарство будет очень трудно. Работу Флеминга продолжили Г. Флори и Э. Чейн, предложившие методы очистки пенициллина. Его массовое производство было налажено во время Второй мировой войны. В 1945 г. А. Флеминг, Г. Флори и Э. Чейн были удостоены Нобелевской премии в области физиологии и медицины.
Эффект от применения пенициллина превзошел все ожидания. По некоторым данным, только в 1940-1950-е гг. с его помощью было спасено от смерти более 15 млн. человек. Действительно, часто раненый погибает не от самой раны, а от гнойного воспаления. Так, рана, полученная А.С. Пушкиным на дуэли, сама по себе не была опасна, но развилось воспаление — перитонит, что и привело к смертельному исходу. При нынешнем состоянии медицины Пушкина можно было бы вылечить с помощью антибиотиков.
Сразу же после открытия пенициллина начались поиски и других антибиотиков. Сейчас их существует уже более 3 тыс., но многие ученые в разных странах мира все время ищут более продуктивные микроорганизмы для их биосинтеза, достигая при этом поразительных успехов. Например, плесень Флеминга в военные годы давала активность по пенициллину не более 10 ед/мл. Современные штаммы микроорганизмов дают 50 тыс. ед/мл того же пенициллина.
Интересно, что в США в послевоенные годы поисками микроорганизмов занимались не только ученые. Институты давали объявления в газеты с просьбой приносить им разные образцы плесеней за вознаграждение. Рассказывают, что в одном из городов этим занималась некая пожилая женщина по имени Мэри. Она по всему городу искала плесень в гнилых фруктах, овощах, испорченном хлебе. Ей даже дали прозвище Заплесневелая Мэри. Так вот, именно она нашла родоначальника современных высокоактивных штаммов биосинтеза пенициллина в заплесневевшей гнилой дыне. Этот микроорганизм был назван Penicillum chrysogenum.
К настоящему времени известно несколько сотен пенициллинов, молекулы которых имеют одну и ту же базовую структуру, но различные боковые цепи. Некоторые из них являются синтетическими, некоторые — полусинтетическими, некоторые — природного происхождения. Они имеют разную специфичность; другими словами, они различаются по эффективности воздействия на разные бактерии. Это является хорошим стимулом для поиска альтернативных форм антибиотика.
Решающее значение имеет состав среды, используемой в процессе ферментации. Предпочтительным источником углерода является глюкоза. Глюкоза обеспечивает рост гриба, однако подавляет продукцию ферментов, необходимых для синтеза пенициллина. Поэтому обычно стимулируют быстрый рост гриба в первые 30—40 ч, а затем добавляют глюкозу в низкой концентрации либо контролируемыми дозами, либо постоянно (т. е. это периодическое культивирование с добавлением субстрата). Источником азота является дешевый белок, например соевая или рыбная мука. Кроме того, в среду добавляют фосфат, карбонат кальция и фенилуксусную кислоту, которые повышают выход продукта, так как они необходимы для образования молекулы пенициллина. Поскольку пенициллин является вторичным метаболитом, он образуется уже после начальной, быстрой фазы роста. К первичным метаболитам, которые формируются на первой фазе роста, относятся, например, такие продукты дыхания, как двуокись углерода и этиловый спирт.
Посевной материал выращивают из спор гриба Penicillum chrysogenum. Для инокуляции ферментера объемом 50 000 дм3 требуется 3—5 тонн мицелия. Поскольку пенициллин необходим в огромных количествах, для его производства построен ферментер объемом до 200 000 дм3. Ежедневно потребляется около 500 кг глюкозы. Выход пенициллина сильно зависит от температуры, которая может подниматься до 2 °С в час, поэтому нужно внимательно следить за этим фактором. Необходимо также контролировать значение рН и поддерживать его между 6,5 и 7,0. Процесс продолжается примерно 15 сут.
Дальнейшая переработка начинается с удаления мицелия путем фильтрации. Пенициллин остается растворенным в жидкой фазе среды. Его экстрагируют серией растворителей. При каждой экстракции удаляется часть примесей, так что пенициллин становится все чище и чище, пока он не окажется растворенным в воде в чистом виде. Затем воду удаляют путем выпаривания в вакууме, а пенициллин кристаллизуется в виде натриевой или калиевой соли (сам по себе пенициллин является слабой кислотой).
Новые антибиотики с уникальными свойствами и специфичностью можно получить путем генно-инженерных манипуляций с генами, участвующими в биосинтезе уже известных антибиотиков. Большой эффект здесь может дать технология рекомбинантных ДНК: с ее помощью можно создавать новые антибиотики с уникальной структурой, оказывающие более мощное действие на определенные микроорганизмы и обладающие минимальными побочными эффектами. Генно-инженерные подходы можно использовать для увеличения выхода антибиотиков и снижения стоимости их производства.
Большинство исследований было сосредоточено на пенициллинах и цефалоспоринах, структура которых включает четырехчленное β-лактамное кольцо. Добавление к β-лактамному кольцу метоксильной (СН3О)-группы привело к появлению цефамицинов, близких к цефалоспоринам и эффективных как против грамотрицательных, так и против пенициллиноустойчивых микробов. Полусинтез состоит в замене химическим путем одной боковой цепи β-лактамного кольца на другую в полученной ферментацией молекуле. Устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам связана с наличием ферментов, так называемых β-лактамаз, которые широко распространены среди бактерий, актиномицетов, цианобактерий и дрожжей. Так как гены, кодирующие эти ферменты, находятся в составе плазмид, устойчивость может передаваться при переносе плазмид от одного бактериального штамма к другому.
Исследователи фирмы «Мерк, Шарп и Доум» открыли новый класс β-лактамных антибиотиков — тиенамицины, — продуцируемые Streptomyces cattleya. Тиенамицины чрезвычайно эффективны против грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также способны ингибировать β-лактама-зы, что значительно повышает возможности этих антибиотиков. К ингибиторам β-лактамаз относятся также клавулановая и оливановая кислоты, идентифицированные исследователями английской фармацевтической компании «Бичем». Компания выпустила антибиотик — аугментин, — который представляет собой комбинацию β-лактамного антибиотика амоксициллина и клавулановой кислоты.
Синтез антибиотика является результатом действия 10-30 генов, поэтому практически невозможно обнаружить отдельные спонтанные мутации, которые могли бы повысить его выход. В промышленных штаммах Penicillium chrysogeпит или Streptomyces auerofaclens выход пенициллина или тетрациклина удалось повысить с нескольких миллиграммов на литр (штамм дикого типа) до 20 г/л и более. Эти высокопродуктивные штаммы были получены в результате последовательных циклов мутагенеза и селекции.
В результате мутаций появились новые вторичные метаболиты, в том числе 6-диметилхлортетрациклин и б-диметилтетрациклин. Определенные мутанты, так называемые идиотрофы, способны синтезировать только половину молекулы антибиотика, а среда должна быть обогащена другой ее половиной. Такая форма мутационного биосинтеза привела к открытию новых производных антибиотиков, в том числе принадлежащих к аминоциклитольной группе.
Создание новых и совершенствование существующих технологий получения антибиотиков, разработка экологически чистых безотходных технологий получения высококачественных препаратов — важнейшая задача современной биотехнологии.