- •Химические свойства
- •Введение
- •Биомедицинское значение
- •Химические свойства
- •Между инсулином чело века, свиньи и быка существует большое сходство.
- •Биосинтез
- •Регуляция секреции инсулина
- •Метаболизм инсулина
- •Физиологические эффекты инсулина
- •Механизм действия инсулина
- •Патофизиология
- •Инсулиноподобные факторы роста
- •Соматостатин
- •Панкреатический полипептид
Химические свойства
Молекула инсулина — полипептид, состоящий из двух цепей, А и В, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками, соединяющими остаток А7 с остатком В7 и остаток А20 с остатком В19. Третий дисульфидный мостик связывает между собой остатки 6 и 11 А-цепи. Локализация всех трех дисульфидных мостиков постоянна, а А- и В-цепи у представителей большинства видов имеют по 21 и 30 аминокислот соответственно. В обеих цепях во многих положениях встречаются замены, не оказывающие влияния на биологическую активность гормона, однако наиболее часты замены по положениям 8,9 и 10 А-цепи. Из этого следует, что данный участок молекулы не имеет критического значения для биологической активности инсулина. Однако некоторые участки и области молекулы инсулина обладают высокой консервативностью.
К ним относятся 1) положения трех дисульфидных мостиков, 2) гидрофобные остатки в С-концевом участке В-цепи и 3) С- и N-концевые участки А-цепи. Использование химических модификаций и замен отдельных аминокислот шести этих участков помогли идентифицировать сложный активный центр. Расположенный на С-конце В-цепи гидрофобный участок участвует также в димеризации инсулина.
Между инсулином чело века, свиньи и быка существует большое сходство.
Инсулин свиньи отличается от человеческого инсулина одной-единственной аминокислотной заменой: вместо треонина в положении 30 В-цепи находится аланин. В бычьем инсулине помимо этого треонин А8 заменен на аланин, а изолейцин А10—на валин. Эти замены практически не влияют на биологическую активность гормона и очень слабо влияют на его антигенные свойства. Хотя у большинства больных, получавших гетерологичный инсулин, обнаруживаются циркулирующие в небольшом титре антитела против введенного гормона, некоторые пациенты демонстрируют титр антител клинически значимой величины. До тех пор пока человеческий инсулин не научились получать с помощью методов генной инженерии, для терапевтических целей использовали обычно бычий и свиной инсулины. Несмотря на значительные различия в первичной структуре, все три инсулина имеют сходную биологическую активность.
Инсулин образует очень интересные сложные структуры. Цинк, концентрация которого в В-клетках достигает высоких значений, формирует комплексы с инсулином и проинсулином. Инсулины всех позвоночных образуют изологичные димеры с помощью водородных связей между пептидными группами остатков В24 и В26 двух мономеров, которые при высоких концентрациях в свою очередь реорганизуются в гексамеры, содержащие по два атома цинка каждый. Наличие такой высоко упорядоченной структуры облегчило изучение кристаллической структуры инсулина. При физиологических концентрациях инсулин находится, вероятно, в мономерной форме.
Биосинтез
А. Предшественники инсулина. Инсулин синтезируется в виде препрогормона (мол. масса 11 500). Он может служить примером пептида, образующегося в результате различных преобразований из более крупной молекулы предшественника. Состоит из 23 аминокислот- гидрофобная лидерная последовательность (пре-фрагмент) направляет молекулу-предшественник в цистерну эндоплазматического ретикулума и там отделяется. В результате образуется молекула проинсулина (мол. масса 9000), принимающая конформацию, необходимую для образования нужных дисульфидных мостиков. Молекула проинсулина имеет следующее строение, считая от аминоконца:
В-цепь -С-пептид-А-цепь
Молекула проинсулина расщепляется в нескольких специфических участках с образованием эквимолярных количеств зрелого инсулина и С-пептида.
Б. Предшественники других гормонов островковых клеток. Синтез других гормонов островковых клеток также требует ферментативного превращения молекул-предшественников с большей молекулярной массой. В образовании этих гормонов участвуют различные комбинации эндопротеолитических (трипсиноподобных) и экзопротеолитических (подобных карбоксипептидазе-В) ферментов, поскольку обладающие гормональной активностью по следовательности могут обнаруживаться в различных участках молекулы-предшественника: соматостатин — на карбоксильном конце молекулы, панкреатический полипетид — на аминоконце, инсулин— на обоих концах и глюкагон — в средней части.
В. Субклеточная локализация синтеза инсулина и формирование гранул. Синтез инсулина и его упаковка в гранулы происходит в определенном порядке. Проинсулин синтезируется на рибосомах шероховатого эндоплазматического ретикулума. Затем в цистернах этой органеллы происходит ферментативное отщепление лидерной последовательности (пре-сегмент), образование дисульфидных мостиков и складывание молекулы. После этого молекула проинсулина переносится в аппарат Гольджи, где начинаются протеолиз и упаковка в секреторные гранулы. Созревание гранул продолжается по мере продвижения по цитоплазме в направлении плазматической мембраны. Как проинсулин, так и инсулин соединяются с цинком, образуя гексамеры, но поскольку около 95% проинсулина превращается в инсулин, то именно кристаллы последнего придают гранулам их морфологические особенности. Наряду с инсулином в гранулах содержатся также эквимолярные количества С-пептида, однако эти молекулы не образуют кристаллических структур. При соответствующей стимуляции зрелые гранулы сливаются с плазматической мембраной, выбрасывая свое содержимое во внеклеточную жидкость путем эмиоцитоза.
Г. Свойства проинсулина и С-пептида. Длина проинсулинов колеблется от 78 до 86 аминокислот, причем эти различия обусловлены длиной С-пептида. Проинсулин имеет ту же растворимость и изоэлектрическую точку, что и инсулин. Он также образует гексамеры с кристаллами цинка и реагирует с антисывороткой к инсулину. Биологическая активность проинсулина составляет менее 5% биологической активности инсулина. Отсюда следует, что большая часть активного центра инсулина в молекуле предшественника замаскирована. Некоторая часть проинсулина секретируется вместе с инсулином, а в определенных ситуациях (опухоль из островковых клеток) он высвобождается в больших количествах, чем в норме. Поскольку период полужизни проинсулина в плазме значительно выше, чем у инсулина, и при этом проинсулин дает сильную перекрестную реакцию с антисывороткой к инсулину, уровень «инсулина», определяемый радиоиммунологическим методом, в некоторых случаях может превышать содержание биологически активного гормона.
Какой-либо биологической активности С-пептида не обнаружено. Эта молекула обладает иными антигенными свойствами, чем инсулин и проинсулин, поэтому иммунологическое определение С-пептида позволяет отличить эндогенносекретируемый инсулин от вводимого гормона и дает возможность судить о количестве эндогенного инсулина в тех случаях, когда его прямое определение оказывается невозможным из-за наличия инсулиновых антител. С-пептиды представителей различных видов характеризуются высокой частотой аминокислотных замен, что подтверждает положение о вероятном отсутствии биологической активности у этого фрагмента.
Д. Предшественники пептидов, родственных инсулину. Структурная организация молекулы прогормона неспецифична для предшественника инсулина. Предшественники близкородственных инсулину пептидных гормонов (релаксина и инсулиноподобных факторов роста) имеют такую же организацию. У всех этих гормонов последовательности А- и В-цепей в молекуле предшественника имеют на карбоксильных и аминоконцах высокогомологичные участки, соединяющиеся между собой связующим пептидом. В пептидных предшественниках инсулина и релаксина по обе стороны от связующего пептида расположены по две основные аминокислоты, соединяющие его с А- и В-цепями. После возникновения между А- и В-цепями дисульфидных мостиков связующий пептид вырезается в результате эндопротеолиза, и молекула превращается в пептидный гормон, состоящий из двух (А и В) цепей. Инсулиноподобные факторы роста, будучи высокогомологичными инсулину и релаксину по своей первичной структуре, тем не менее имеют одно важное отличие: в молекуле их предшественника отсутствуют участки, по которым происходит отщепление связующего пептида, и поэтому активные гормоны сохраняют структуру единой полипептидной цепи.
Е. Ген инсулина человека. Ген человеческого инсулина локализован в коротком плече хромосомы 11. У большинства млекопитающих экспрессируется один ген инсулина, организованный подобно человеческому гену, но у крыс и мышей имеются два неаллельных гена. В каждом из них закодирован особый проинсулин, дающий начало двум различным активным молекулам инсулина. В настоящее время разработан метод получения человеческого инсулина в бактериальных экспрессирующих системах с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Таким образом, проблему получения этого гормона в количествах, необходимых для больных диабетом, можно считать решенной.
Ж. Аномальные продукты гена инсулина человека. Знание структуры инсулинового гена и инсулиновой молекулы позволяет выявлять аномальные продукты гена, что в свою очередь дает дополнительную информацию о функции данного гормона. Выявлены три мутации этого гена, причем для каждой из них идентифицирована молекулярная основа дефекта. В одном случае в результате мутации единичного основания на месте фенилаланина-В24 оказался серии, в другом (опять-таки в результате единичной мутации) произошла замена фенилаланина-В25 на лейцин. В третьем случае изменился процессинг проинсулина в активный гормон: мутация нарушила отщепление З'-конца С-пептида на границе с А-цепью. В основе этого дефекта лежит замена дипептида Lуs-Агg в этом месте полипептидной цепи на Lуs-Х, в результате которой трипсиноподобное расщепление оказалось невозможным. Выявлению описанных мутаций способствовала их локализация в активном центре молекулы инсулина, в результате чего у соответствующих носителей 1) имеет место гиперинсулинемия, 2) отсутствуют признаки инсулинорезистентности, 3) снижена биологическая активность циркулирующего в крови инсулина и 4) отмечается нормальная реакция на экзогенный инсулин. По крайней мере еще четыре нуклеотидные замены были идентифицированы у «здоровых» людей. Эти мутации локализованы во вставочных (т. е. некодирующих) последовательностях, и на функциональную активность молекулы инсулина они не повлияли.