Фактори, що визначають процес нарощування клітин

Збільшення масштабу культивування є можливим лише при задоволенні всіх хімічних та фізичних потреб клітин. Хімічні фактори потребують постійної перевірки оточуючого середовища і контролю вмісту клітин в певних фізіологічних умовах. Ці фактори, до числа яких відноситься кисень, рН, компоненти середовища, а також процес видалення продуктів відходів.

Типи культуральних систем

Непроточні культури. Це звичайний тип культур, у якому клітини вводять до фіксованого об’єму середовища. По мірі росту клітин відбувається використання харчових речовин і накопичення метаболітів. Середовище, таким чином, повинно постійно змінюватися, що у свою чергу приводить до зміни клітинного метаболізму. З часом однак проліферація припиняється внаслідок вичерпання харчових речовин, накопичення токсичних продуктів відходів, що залежить від щільності обмеження росту у моношарових культурах. Існують методи збільшення часу життя непроточних культур і, відповідно, збільшення виходу клітин шляхом різних способів “підкормки” субстратами:

1. Переривчастий (при цьому певна частина культури замінюється на рівний об’єм свіжого середовища.

2. Постійний (об’єм культури збільшується з постійною низькою швидкістю, а невеликі порції клітин періодично вилучаються).

3. Перфузійний (здійснюється постійне надходження свіжого середовища в культуру і одночасне видалення рівного об’єму використаного середовища без клітин). Перфузія може бути відкритою, коли із системи вилучається все середовище, і закритою, коли середовище, що вилучається з культури, проходить крізь додатковий сосуд і повертається до культурального сосуду. Додатковий сосуд використовується для “регенерації” середовища шляхом його аерації і доведення рН.

Всі системи непроточних культур у тій чи іншій мірі накопиченням відходів і непостійністю зовнішніх умов. Ці системи придатні для культивування клітин як у моношарі, так і у суспензії.

Проточні культури

Ці системи забезпечують справжні гомеостатичні умови без зміни концентрації поживних речовин і метаболітів, а також числа клітин. Гомеостаз обумовлюється постійним надходженням середовища в культуру і одночасним вилученням рівного об’єму середовища з клітинами. Тому такі системи придатні тільки для суспензійних культур і моношарових культур на мікроносіях.

Вибір між непроточною і проточною культурами

Культури з постійним протоком являють собою єдину систему, у якій всі клітини гомогенні і можуть зберігати гомогенність на протязі довгого періоду (місяці). Ця властивість має велике значення для фізіологічних досліджень, однак такі культури є занадто коштовними для отримання клітинних продуктів. Вартість отримання цих продуктів визначається витратою часу обслуговуючого персоналу, а також вартістю середовища та обладнання. При оцінці вартості слід також приймати до уваги складність обладнання та процесів, що використовуються, оскільки саме ці фактори визначають необхідну кваліфікацію персоналу і впливають на надійність процесу виробництва продуктів. Непроточне культивування – дорогий і трудомісткий процес, оскільки для кожного одиничного збору клітин потрібні пересів і інкубація для отримання кінцевої культури. Певний режим для непроточної культури може забезпечити повторні, хоча і менш врожайні збори продукту, і чим довше підтримується культура у продуктивному стані, тим дешевшим виявляється процес отримання продукту в цілому. Однак для підтримання клітинної популяції на високому рівні на протязі достатньо довгого часу, часто виявляється необхідним збільшення об’ємів середовища, і якщо при цьому необхідно використовувати дорогі ростові фактори, то такий варіант перестає бути економічно вигідним. Підтримка високого рівня клітин, і, внаслідок цього, високої концентрації кінцевого продукту, може виявитися необхідним для зниження вартості всього процесу і переважити, таким чином, збільшення вартості середовища. Культивування клітин у постійному протоці у хемостаті не може забезпечити максимальний вихід клітин, оскільки у цій системі діє фактор, обмежуючий ріст клітин. Для деяких практичних застосувань, наприклад отримання цитопатичних вірусів, не залишається іншого вибору, ніж використання непроточних культур.

Фізичні параметри, що визначають процес нарощування клітин, включають в себе конфігурацію біореактората його енергозабезпечення. Функція перемішуючого ротора полягає у перетворенні енергії (що виражається у кВт/м³) в гідродинамічне перемішування у трьох напрямках – осьовому, тангенціальному та радіальному. Ротор повинен забезпечувати циркуляцію у всьому об’ємі рідини і створювати турбулентність (він повинен і качати, і змішувати) для вирішення таких задач: створення гомогенної суміші, підтримання клітин у суспензії, оптимізації швидкості переносу маси між різними фазами системи (біологічною, рідинною та газовою), збільшення теплопередачі.

Ефективне перемішування стає все більш складною проблемою при збільшенні об’єму культури, і особливі проблеми пов’язані з розсіюванням енергії, що підводиться для підтримання гомогенності. Лімітуючим фактором є енергія, що генерується на кінцях лопатей мішалки, оскільки ця енергія є джерелом пошкоджуючих сил зсуву. Сили зсуву створюються змінними швидкостями протікання рідини у ділянках турбулентності. Факторами, що впливають на цей процес є: форма ротора (вона визначає первинний напрямок індукованого току рідини), відношення діаметрів ротора та посудини, швидкості обертання кінців мішалки (функція швидкості обертів і діаметра лопатей). Чим вищою є турбулентність, тим ефективнішим виявляється перемішування, але, щоб не пошкодити клітини, слід досягати компромісу. Великі ротори, що обертаються з низькою швидкістю, створюють низьку силу зсуву і володіють високою здатністю до перекачування, тоді як маленькі ротори потребують високих швидкостей обертання і створюють високу силу зсуву. Це виявилося передумовою для створення мішалок спірального типу.

Магнітний стрижень індукує тільки радіальні переміщення і не викликає підйому рідини та турбуленцій. Ротор типу морського гвинта більш ефективний у суспензійних культурах, ніж ротор типу турбіни з плоскими лопатями, що застосовується у багатьох бактеріальних системах, оскільки ротор типу гвинта забезпечує краще перемішування при низьких швидкостях обертання. Якщо клітини занадто крихкі або якщо достатнього перемішування неможливо досягти при швидкостях, які ще не створюють пошкоджуючих сил зсуву, застосовують інші системи перемішування з використанням пневматичної енергії (перемішування при пробулькуванні повітря), або гідравлічної енергії (перфузія середовищем). Використання цих методів дозволяє збільшувати масштаб культивування без без підвищення потужності, що підводиться. Для збільшення ефективності механічного перемішування змінювати конструкцію лопатей мішалки або використовувати декілька роторів.

Існує і принципово відмінна перемішування, яка застосовується у деяких випадках. При цьому використовується вібратор, який не обертається. Вібратор створює перемішування середовища за рахунок переміщень з амплітудою 0,1-3 мм і з частотою 50 Гц. Перемішуючий диск монтується на валу вібратора у горизонтальному положенні, і конічні отвори у диску надають йому накачуючу дію при вертикальному переміщенні валу туди і назад. При цьому привід валу до двигуна здійснюється за допомогою електричної діафрагми у верхній частині культуральної посудини. Перевага цієї системи полягає у помітно знижених силах зсуву, безпорядковому змішуванні, зниженні піноутворення і зменшенні енергії, що споживається, що є особливо важливим при збільшенні масштабів культивування.

Перехід від магнітних мішалок до систем з прямим приводом здійснив помітний вплив на конструкцію сосудів, оскільки у останньому випадку привід повинен проходити крізь сосуд. Це дещо ускладнює конструкцію, оскільки виникає необхідність у створенні асептичної перехідної муфти з підшипниками, що змащуються, для приводу у верхній або нижній кришці сосуда.

Як вже відмічалося, збільшення масштабу культивування не є пропорційним процесом. Скажімо, перетворення 1-літрового реактора на 1000-літровий не може бути здійснено простим відповідним збільшенням його розмірів. Причини цього є чисто математичними: збільшення діаметра сосуда у 2 рази супроводжується 4-разовим збільшенням об’єму, що різними шляхами впливає на різні фізичні параметри системи. Одним з факторів, які слід приймати до уваги, є відношення висоти до діаметра – один з найбільш важливих параметрів при створенні ферментерів.

Газозабезпечення суспензійних культур при культивуванні.

Можливість збільшення масштабу культивування клітин тварин у значній мірі залежать від забезпечення культури киснем, що при цьому не супроводжується пошкодженням клітин. Кисень розчиняється у культуральному середовищі лише до певного рівня (7,6 мкг/мл). Середня швидкість споживання клітинами кисню складає 6 мкг/10⁶ клітин/год. Таким чином, у типовій культурі з концентрацією 2  10⁶ клітин/мл виснаження розчиненого у середовищі кисню (7,6 мкг/мл) відбудеться менш ніж за годину. Необхідно, таким чином, постачати кисень до середовища на протязі всього життєвого циклу культури, і можливість адекватного рішення цієї проблеми залежить від швидкості переносу кисню (ШПК) в системі:

де ШПК – кількість перенесеного О₂/одиниця об’єму/одиниця часу; К1 – коефіцієнт переносу кисню; а – площа поверхні, крізь яку здійснюється перенос кисню (оскільки ця величина може бути виміряна лише у стаціонарних та поверхнево аерованих культурах, звичайно використовують параметр К1а, що має розмірність [об’єм/час] і являє собою коефіцієнт переносу маси), С* - концентрація розчиненого кисні в середовищі при насиченні і С – дійсна концентрація кисня у даний момент часу.

При С = 0 параметр К1а (ШПК/С*) має розмірність год^-1, і таким чином, може слугувати показником часу, необхідного для повної оксигенації даного культурального сосуду у даних експериментальних умовах.

Аерація культури може бути досягнута за допомогою: поверхневої аерації, пробулькування, дифузії крізь мембрани, перфузії середовища, збільшення парціального тиску О₂, збільшення атмосферного тиску, або комбінації цих методів.

Поверхнева аерація в статичних культурах. У закритих культуральних сосудах важливим фактором є кількість кисню в системі і його доступність для клітин, що ростуть під 3-6-міліметровим шаром середовища. Зазвичай в статичних культурах використовується відношення об’єму газової фази до об’єму середовища 10 : 1. При такому співвідношенні культури виявляються у достатній мірі забезпечені киснем. Так, сосуди ємністю 1 л (наприклад, флакони Ру) з 900 см³ повітря та 100 см³ середовища містять спочатку 0,2776 г кисню. Цієї кількості кисню вистачає для підтримання 10⁸ клітин на протязі 450 год, що повністю достатньо. Другим фактором є доступність цього кисню для клітин. Швидкість транспорту кисню з повітряної фази у водну складає біля 17 мкг/см²/год. Цього більш ніж досить для клітин, що ростуть у літровому сосуді. Однак якщо середовище у поверхні буде насичуватися киснем, а його концентрація біля моношару клітин близька до нуля, то швидкість дифузії кисню у клітинах, складе біля 1,5 мкг/см²/год. За такої швидкості дифузії кисень забезпечує підтримку біля 50  10⁸ клітин у літровому сосуді. Для виконання багатьох робіт, що проводяться з культурами клітин, така щільність клітин є достатньою.

Поверхнева аерація у перемішуваних культурах. Насичення клітинної суспензії киснем залежить від швидкості обертання, конфігурації імпелера і геометрії біореактора. Значення К1а визначається експериментальним шляхом, але звичайно аерація не перевищує таку, що забезпечується поверхневим захопленням кисню, якщо швидкість обертів не перевищує 100 обертів/хвилину. З огляду на те, що швидкість перемішування зазвичай не перевищує декількох сотень обертів на хвилину (через низьку фізичну толерантність клітин ссавців) переміщення мас є незначним і тому перенесення кисню забезпечується головним чином саме ефектом поверхневого захопленняя. Внаслідок цього, коли в конструкції спеціально не передбачається оксигенерування або зміна середовища, співвідношення глибини робочого об’єму середовища до діаметра реактора не повинне перевищувати 2:1.

Поліпшення постачання киснем культуральних систем проводиться в основному за принципом конструювання перемішуючих пристроїв. Так, для досягнення інтенсифікації газозабезпечення, використовують поверхневий аератор, який являє собою диск з отворами або горизонтальними лопатями, розташований на центральному валу на рівні розділу фаз. Використання поверхневого аератора дозволяє значно збільшити коефіцієнт масопередачі.

Зараз для насичення клітинної суспензії киснем досить часто використовують перфторвуглеці й емульсії на його основі. У цьому випадку оксигенерування перфторвуглеці подаються у верхню частину реактора. При контакті рідина-рідина кисень переноситься у водну фазу в процесі осідання краплі перфторвуглецю на дно реактора через різницю в щільності, і збирається на дні. Після цього він видаляється в оксигенератор і цикл повторюється.

Пропускання бульбашок газу через середовище є надзвичайно ефективним засобом збільшення переносу кисню. Однак цей метод може бути небезпечним для клітин тварин внаслідок пошкоджуючої дії бульбашок на клітинні мембрани внаслідок високої поверхневої енергії. Пошкоджуюча дія може бути знижена при використанні великих бульбашок повітря (які характеризуються меншою поверхневою енергією у порівнянні з дрібними бульбашками) шляхом зниження швидкості подачі повітря та додавання препарату плуронік F-68. При використанні пробулькування (барботажу) ефективність оксигенації підвищується в культуральних сосудах з високим відношенням висоти до діаметра, оскільки високий тиск у дна таких сосудів збільшує розчинність кисню.

У випадку, якщо припустиме використання барботажу як для аерації, так і перемішування клітинної суспензії, використовується бульбашкові барботажні колонки – ерліфтні біореактори. Для прямого барботування культуральної рідини розроблений розпилювач, що дозволяє зменшити розмір пухирців газу. Це, у свою чергу, приводить до зменшення таких негативних ефектів, як піноутворення, винос і підсихання мікроносіїв у випадку їх застосування.

Слід однак зазначити, що широке застосування ерліфтних біореакторів обмежене однією обставиною методичного характеру. У більшості середовищ для культивування клітин тварин, як і в крові, в якості компоненту, підтримуючого рівень рН, використовується бікарбонатний буфер. У розчині бікарбонату здійснюється рівновага:

NаНСО₃ + Н₂О → Н₂СО₃ + NаОН

але вугільна кислота, будучи нестійкою кислотою, розкладається на СО₂ і Н₂O:

H₂CO₃ → CO₂↑ + H₂O

Якщо СО₂ видаляється з середовища внаслідок інтенсивного барботажу, то рівновага зміщується вправо, тобто відбувається зміна рН середовища убік залужування. Для підтримки рН використовують збільшення концентрації амінокислот або заміну бікарбоната різними синтетичними органічними буферами.