Процедура:

Готовят следующие реакционные смеси:

	Опыт	Контроль*	Контроль**
0,0125 М Na-фосфатный буфер	до 1 мл	0,8 мл	до 1 мл
0,02 М L-аспарагин	0,2 мл	0,2 мл	-
L-аспарагиназа, полученный раствор разводят холодной деиониз водой до 2,0-4,0 МЕ/мл перед опытом.	0,1-0,5 мл	-	0,1- 0,5 мл

Образцы инкубируют при 37°С в течение 5-30 мин, в зависимости от активности фермента. Реакцию останавливают добавлением 0,5 мл ледяной 20%-ной ТХУ, оставляют на 5 мин. при 0°С, затем пробу встряхивают на Вортексе и центрифугируют в течение 5 мин при 10000 об/мин на центрифуге Эппендорф. В стеклянные пробирки отбирают 0,25 мл супернатанта, доводят деионизованной водой до объема 2,25 мл, после чего добавляют 0,25 мл реактива Несслера и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре.

Измеряют значение А₅₀₀опытных проб при длине волны 500 нм по отношению к соответствующим контролям. Контроль* - на неэнзиматический гидролиз L-аспарагина. Контроль** - на присутствие эндогенного аммиака во фракции фермента.

Расчет активности проводят по следующей формуле:

Активность (мкмоли NH₄/мин)= разбавление фермента до 1 мл ×15 × А₅₀₀ ,

время инкубации

где 15 – разбавление аликвоты 0,25 мл из инкубационной смеси (1,5 мл после добавления раствора 20%-ной ТХУ) до конечнго объема (2,5 мл) в реакции несслеризции.

3. Определение активности l-аспарагиназы

Активность аспарагиназ выражается в международных единицах (МЕ). За 1 МЕ активности фермента принимается его количество, катализирующее высвобождение из L-аспарагина 1 мкмоль аммиака за 1 мин в оптимальных условиях инкубационной среды.

Количество образовавшегося в ходе ферментной реакции NH₃ определяют по калибровочной кривой. Из-за относительной нестабильности реактива Несслера (даже при постоянном хранении в холодильнике) калибровочную кривую ежемесячно уточняют.

Удельная активность фермента рассчитывается на 1 мг белка. Количество белка в растворе аспарагиназы определяют либо по методу Лоури, либо спектрофотометрически. Измерение проводят на спектрофотометре при длине волны 280 нм, принимая за коэффициент экстинкции ε^0,1% ₂₈₀ = 0,6.

Примечание

Построение стандартной калибровочной кривой:

Используя 2 мМ раствор NH₄CI в пробирках готовят растворы хлорида аммония в диапазоне концентраций 0,1 – 1,1 мкМ (объем этих растворов не может быть больше 2,25 мл), затем добавляют 0,25 мл реактива Несслера и измеряют А₅₀₀ проб при длине волны 500 нм по отношению к контролю – деионизованной воде.

Кривую строят, размещая по оси абсцисс количество аммиака, мкМ/мл, по оси ординат – величины А₅₀₀.

4. Иммобилизация клеток

В наших исследованиях иммобилизацию клеток проводили в асептических условиях. К суспензии клеток добавляли 3% раствор альгината натрия в соотношении 1:1, перемешивали и переносили в иньектор, с помощью которого получали альгинатные гранулы в 250 мМ CaCl₂. По истечении 20 минут стабилизации гранулы трижды промывали дистиллированной водой и помещали для инкубации в среду Мурасиге и Скуга, содержащую фитогормоны в необходимых концентрациях. Иммобилизованные клетки инкубировали в термостате при температуре 25ºС на качалках ротационного типа (скорость перемешивания 100-120 об/мин).

Деиммобилизация клеток. Для определения физиологических и биохимических параметров иммобилизованных клеток необходимо освободить клетки от носителя. С этой целью кальций-альгинатные гранулы с клетками помещали в раствор 0,1 моль/л цитрата натрия и непрерывно перемешивали барботированием воздухом до полного растворения геля. Клетки отделяли от раствора цитрата натрия фильтрованием через бумажный фильтр.

В ряде случаев удаление носителя проводили при выдерживании клеток в течение 1ч в среде ½ MS с добавлением калий фосфатного буфера при рН 7,5.

Экстракция веществ. Для определения качественного и количественного содержания биологически активных веществ в клеточных культурах приготавливаются экстракты. Вначале материал высушивается. Для выделения различных классов вторичных метаболитов экстракцию сухого сырья поводят ацетонитрилом, гексаном, хлороформом, водой, метиловым спиртом, 70 % и 94 % этиловым спиртом согласно Государственной Фармакопеи. В случае иммобилизованных клеток экстракции предшествовала процедура снятия носителя.

Выделение фенольных соединений, а также флавоноидов из растительного материала проводили последовательным экстрагированием 94 и 70% этанолом при 25ºС. Полноту извлечения определяли по реакции с NaHCO₃. Экстракция гидроксикоричных кислот осуществлялась с помощью 40%-го этанола при нагревании с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 45 мин.

Идентификация физиологически активных соединений проводилась несколькими способами.

Спектрофотометрический и флуорометрический анализ. Для спектрофотометрического анализа экстракты разбавлялись в 20 раз соответствующими растворителями. Спектры поглощения экстрактов анализировали с помощью спектрофотометра Varian Cary 50.

Сумму растворимых фенольных соединений определяли спектрофотометрически с помощью реактива Фолина-Дениса (смесь фосфомолибденовой и вольфрамовой кислот) по Суэйну и Хиллису [26] с некоторыми модификациями. Максимум поглощения окрашенных растворов соответствует длине волны 720-750 нм.

Для спектрофотометрического анализа в пробирку вносили: 0,5 мл полученного экстракта или 1 мл среды (в которой культивировались клетки), 7 мл дистиллированной воды; 0,5 мл реактива Фолина-Дениса; 1 мл насыщенного раствора Na₂CO₃; 1 мл (в случае экстракта) или 0,5 мл (при определении в среде) дистиллированной H₂O и встряхивали. Полученную смесь оставляли на 1 ч до проявления окраски и использовали для определения оптической плотности при λ=725 нм. Контрольный раствор содержал все компоненты смеси, только вместо исследуемого экстракта или среды добавляли такое же количество спирта или воды соответственно.

Расчет содержания фенольных соединений в клетках в пересчете на хлорогеновую кислоту производили по формуле:

С_ф=а∙V∙р / m,

где С_ф – содержание фенольных соединений, мг/г сухой массы клеток;

а – содержание хлорогеновой кислоты, определяемое по калибровочному графику, мг/мл;

V – объем спиртовой вытяжки из клеточной биомассы, мл;

р – степень разведения;

m – масса навески , г.

Количественное определение суммы гидроксикоричных кислот производили согласно [27]. Полученный экстракт фильтровали через бумажный фильтр, измеряли его объем (раствор А), а затем в опытную пробирку вносили 1 мл экстракта и 9 мл дистиллированной воды (раствор В). Оптическую плотность раствора измеряли на спектрофотометре при длине волны 330 нм. Cодержание суммы гидроксикоричных кислот в пересчете на цикориевую кислоту и сухое сырье в процентах рассчитывали по формуле:

Х = (D∙V_A∙V_B) / (m ∙ 782),

где D – оптическая плотность экстракта при 330 нм;

V_A – объем раствора А, мл; V_B – объем раствора В, мл; 782 – удельный показатель поглощения цикориевой кислоты при 330 нм; m – масса сырья, г.