Рабочая тетрадь для лабораторно-практических занятий и самостоятельной работы по дисциплине «биотехнология»
Новосибирск 2008
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ
УНИВЕРСИТЕТ
РАБОЧАЯ ТЕТРАДЬ
для лабораторно-практических занятий
и самостоятельной работы по дисциплине
«БИОТЕХНОЛОГИЯ»
Группа________________________
Студент________________________
Новосибирск – 2008
Кафедра ветеринарной генетики и биотехнологии
Рабочая тетрадь для лабораторно-практических занятий и самостоятельной работы по дисциплине «Биотехнология»/ Новосиб. гос. аграр. ун-т; сост.: В.Г. Маренков. – Новосибирск, 2008. - 36 с.
Рецензент: докт. с.-х. наук, профессор А.И. Желтиков
Рабочая тетрадь предназначена для изучения дисциплины ОПД. Р 02 «Биотехнология» студентами, обучающимися по специальности 110401 «Зоотехния».
Утверждена и рекомендована к изданию методической комиссией Биолого-технологического института НГАУ (протокол № ___ от ____октября 200___ г.).
ОГЛАВЛЕНИЕ
I. ЛАБОРАТОРНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ
Занятие 1. Отбор коров-доноров эмбрионов………………………….….5
Занятие 2. Составление схем гормональных обработок
доноров и реципиентов…………………………………….....7
Занятие 3. Нехирургический способ вымывания и пересадки
эмбрионов………………………………………………………9
Занятие 4. Лабораторная работа: «Получение мышиных
эмбрионов»…………………………………………………….13
Занятие 5. Определение стадии развития и качества эмбрионов………15
Занятие 6. Оборудование и организация работы в
ПЦР-лаборатории…………………………………………..…18
II. ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
Раздел Биотехнология воспроизводства ………………………………21
Раздел Молекулярная биотехнология (генетическая
инженерия)……………………………………………………….24
III. ЗАДАНИЯ ДЛЯ ПРОВЕРКИ ЗНАНИЙ
Вопросы для проверки теоретических знаний…………………………26
Вопросы для подготовки к зачету……………………………………….35
Литература, использованная при составлении рабочей тетради……..36
I. Лабораторно-практические занятия
Занятие 1.
ОТБОР КОРОВ-ДОНОРОВ ЭМБРИОНОВ
Цель занятия: научиться выявлять в стаде коров – потенциальных доноров эмбрионов.
Учебные материалы: данные зоотехнического учета, инструкция по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота
Требования, предъявляемые к коровам-донорам эмбрионов:
1.
2.
3.
4.
5.
Задание1. В таблице 1 приведен список высокопродуктивных коров одного из племенных заводов. Средняя продуктивность стада составляет 5850 кг молока за лактацию. Рассчитайте Sd, ИП, возраст коров. Выберите животных, которых можно было бы использовать в качестве доноров эмбрионов.
Таблица 1
№ коровы |
Живая масса, кг |
Удой за лактацию, кг |
Жир, % |
Жир, кг |
Sd, кг |
Дата отела |
Приплод, гол |
ИП |
Возраст |
Заключение |
|
первого |
последнего |
||||||||||
8718 |
726 |
7316 |
4,02 |
294,1 |
|
12.06.2005 |
14.03.2007 |
3 |
|
|
|
8717 |
525 |
7595 |
4,18 |
317,5 |
|
4.05.2006 |
30.10.2007 |
2 |
|
|
|
8714 |
561 |
9073 |
3,99 |
362,0 |
|
5.12.2005 |
3.01.2008 |
3 |
|
|
|
8713 |
523 |
8456 |
4,04 |
341,6 |
|
27.10.2004 |
4.12.2007 |
5 |
|
|
|
8705 |
627 |
8985 |
3,95 |
354,9 |
|
6.10.2006 |
25.11.2007 |
2 |
|
|
|
8703 |
549 |
8100 |
3,95 |
320,0 |
|
7.08.2003 |
7.10.2007 |
5 |
|
|
|
8689 |
610 |
8370 |
4,03 |
337,3 |
|
18.03.2003 |
15.12.2007 |
5 |
|
|
|
8687 |
634 |
7700 |
4,20 |
323,4 |
|
13.02.2004 |
23.01.2008 |
4 |
|
|
|
8685 |
547 |
8035 |
3,90 |
313,4 |
|
3.04.2003 |
12.11.2007 |
5 |
|
|
|
8682 |
597 |
7609 |
4,30 |
327,2 |
|
29.04.2003 |
8.09.2007 |
5 |
|
|
|
8680 |
542 |
7581 |
4,11 |
311,6 |
|
12.05.2003 |
30.11.2007 |
5 |
|
|
|
8679 |
610 |
8592 |
3,99 |
342,8 |
|
26.08.2005 |
22.12.2007 |
3 |
|
|
|
8671 |
583 |
8303 |
4,18 |
347,1 |
|
5.06.2004 |
17.10.2007 |
4 |
|
|
|
8661 |
624 |
8316 |
3,99 |
331,8 |
|
17.03.2004 |
28.09.2007 |
4 |
|
|
|
8655 |
549 |
9328 |
4,11 |
383,4 |
|
30.12.2003 |
19.10.2007 |
4 |
|
|
|
8658 |
528 |
8999 |
3,91 |
351,9 |
|
24.09.2005 |
5.09.2007 |
3 |
|
|
|
8663 |
554 |
8695 |
4,01 |
348,7 |
|
19.10.2004 |
13.11.2007 |
3 |
|
|
|
8614 |
610 |
7764 |
4,09 |
317,5 |
|
31.10.2004 |
18.10.2007 |
4 |
|
|
|
8601 |
620 |
8315 |
3,87 |
321,8 |
|
3.07.2004 |
25.12.2007 |
4 |
|
|
|
8519 |
605 |
8985 |
3,68 |
330,6 |
|
8.06.2005 |
9.11.2007 |
3 |
|
|
|
Занятие 2
СОСТАВЛЕНИЕ СХЕМ ГОРМОНАЛЬНЫХ ОБРАБОТОК
ДОНОРОВ И РЕЦИПИЕНТОВ
Цель занятия: научиться составлять технологические карты суперовуляции доноров и синхронизации реципиентов
Учебные материалы: инструкция по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота
Задание 1. Начертите общие схемы гормональных обработок доноров и реципиентов.
Схема вызывания суперовуляции
Дни полового цикла
Схемы стимуляции синхронизации охоты:
с применением прогестагенов
Дни введения
препарата
с применением простагландина Ф2α
Дни введения
препарата
Задание 2. Для получения 50 телят методом трансплантации эмбрионов составьте календарный план проведения суперовуляции доноров (из таблицы 1) и синхронизации реципиентов. Среднее число эмбрионов от донора – 7- 8, приживляемость эмбрионов – 50 - 56%.
Таблица 2
Доноры
№, кличка донора |
Стимуляция охоты |
Вызывание суперовуляции |
Вымывание эмбрионов |
Число эмбрионов |
||||
введение прогестагенов |
выведение прогестагенов |
охота |
ФСГ |
ПГФ2α |
суперовуляция |
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Реципиенты
К донору № |
Кол-во, гол |
Стимуляция охоты ПГФ2α |
Пересадка эмбрионов |
Проверка на стельность |
Приживляемость |
Получено телят |
||
первая инъекция |
вторая инъекция |
Охота |
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Занятие 3
НЕХИРУРГИЧЕСКИЙ СПОСОБ
ВЫМЫВАНИЯ И ПЕРЕСАДКИ ЭМБРИОНОВ
Цель занятия: ознакомиться с инструментарием и техническими приемами нехирургического вымывания и пересадки эмбрионов.
Оборудование: инструменты для нехирургического вымывания и пересадки эмбрионов крупного рогатого скота, видеофильм «Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота».
Задание 1. Опишите инструменты и материалы, применяемые при нехирургическом вымывании эмбрионов из донора.
1
.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Задание 2. На основании просмотра видеофильма опишите технологические операции нехирургического вымывания эмбрионов
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Задание 3. Опишите инструменты и материалы, применяемые при нехирургической пересадке эмбрионов.
1
.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Задание 4. На основании просмотра видеофильма опишите технологические операции нехирургической пересадки эмбрионов
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Зарисуйте схему расположения ипсилатерального и контрлатерального рогов матки
Занятие 4.
Лабораторная работа
ПОЛУЧЕНИЕ МЫШИНЫХ ЭМБРИОНОВ.
Цель занятия: освоить технику получения мышиных эмбрионов, научиться вести поиск эмбрионов, определять стадии их развития и качество.
Оборудование и материалы: самки лабораторных мышей, препаровальные иглы, шприцы, физиологический раствор, чашки Петри, пинцеты, ножницы, микроскоп МБС-10, фотографии эмбрионов разных стадий и качества.
Задание 1. Следуя указанной ниже инструкции, попытайтесь извлечь из самки мыши эмбрионы, определить их стадии развития и провести морфологическую оценку качества.
Ход работы:
1
.
Для получения эмбрионов используют
самок мышей на
2-3 дне беременности. Умертвите самку мыши
путем сдвигания шейных позвонков.
2. Вскройте брюшную стенку мыши. Сдвиньте кишечник в
сторону грудной клетки. Найдите рога матки.
3. Отпрепарируйте рога матки и удалите их вместе с
яйцеводами и яичниками с помощью пинцета и
ножниц. Поместите органы в чашку Петри с
физиологическим растворомфизраствором.
4
.
Поместите чашку Петри с промывным
раствором
на предметный столик микроскопа. При
увеличении 20 × попытайтесь обнаружить в
жидкости эмбрионы или яйцеклетки.
5. Найденные эмбрионы или яйцеклетки
рассмотрите при большем
увеличении. Проведите
морфологическую
оценку,
определите стадию
развития,
состояние (качество)
эмбриона.
6. Зарисуйте, что Вы увидели под микроскопом. Сделайте необходимые
подписи.
Занятие 5.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТАДИИ РАЗВИТИЯ И КАЧЕСТВА ЭМБРИОНОВ.
Цель занятия: получить навык визуальной оценки возраста, стадии развития и качества эмбрионов
Учебные материалы: фотографии эмбрионов, шкала морфологической оценки качества.
Задание 1. Подпишите под фотографиями эмбрионов стадию развития, возраст и оценку по морфологической шкале оценки качества.
1.____________________ 2. _______________ 3._______________
4.__________________ 5._________________ 6._______________
7.___________________ 8.__________________ 9._______________
10.__________________ 11.________________ 12.________________
13.____________________ 14._________________ 15.________________
16.____________________ 17._______________ 18._____________
19.__________________ 20.______________ 21.________________
Шкала оценки качества морул и бластоцист
Стадия развития
|
Морфологическая характеристика |
Оценка |
Морула |
||
Мо1 (ранняя) Мо 2 (поздняя) |
Округлая форма, целая прозрачная оболочка, перивителллиновое пространство прозрачное, бластомеры четкие, одинаковые с наличием полигональной связи, цитоплазма мелкозернистая, равномерно заполняет клетку. |
5 (отличные) |
Наличие гранул, включений в перивителлиновой пространство, бластомеры неодинаковые, расположены несимметрично. |
4 (хорошие) |
|
Гранулы, включения в перивителлиновом пространстве, незначительное сжатие бластомеров, единичное разрушение, «частичный зародыш» |
3 (удовлетворительные) |
|
Деформация прозрачной оболочки, частичное разрушение бластомеров разрушение связи между ними, фрагментация цитоплазмы. |
2 (условно годные) |
|
Несоответствие стадии развития возрасту эмбриона, дефекты прозрачной оболочки (трещины, сколы) распад бластомеров. |
1 (непригодные) |
|
Бластоциста |
||
Бла 1 (ранняя) Бла 2 (поздняя) |
Округлая форма, целая прозрачная оболочка имеет одинаковую толщину на всем протяжении, перивителллиновое пространство прозрачное, узкое, четкая дифференциация клеток на трофобласт и эмбриобласт |
5 (отличные) |
Полость бластоцисты не выражена, в перивителлиновом пространстве гранулы, включения, клетки трофобласта сжаты незначительно |
4 (хорошие) |
|
Перивителлиновое пространство увеличено, имеет включения, гранулы, бластополость не выражена, нет дифференциации между клетками трофобласта и эмбриобласта |
3 (удовлетворительные) |
|
Дефект прозрачной оболчки, трещины, наличие гранул в перивителлиновом пространстве, частичное разрушение клеток, сжатие бластомеров. |
2 (условно годные) |
|
Значительный дефект прозрачной облочки, сжатие бластомеров. |
1 (непригодные) |
|
Занятие 6.
ОБОРУДОВАНИЕ И ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТЫ В ПЦР-ЛАБОРАТОРИИ
Цель занятия: ознакомиться с оборудованием ПЦР-лаборатории, его назначением, применением при диагностике инфекционных и наследственных болезней, установлении генотипических особенностей животных.
Материалы и оборудование: ПЦР-лаборатория, образцы электрофореграмм
Задание 1. Опишите оборудование ПЦР-лаборатории
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Задание 2. Для ДНК-диагностики бруцеллеза в исследуемых образцах проводится ПЦР-амплификация специфического фрагмента ДНК возбудителя длиной 148 п.н. На электрофореграмме представлены результаты ПЦР-анализа нескольких образцов. Определите, какие животные заражены возбудителем.
Заключение
-
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Задание 3. У человека ген амелогенина (AMG) – белка, образующего структурный матрикс зубной эмали, локализован в половых хромосомах Х и Y. При этом аллель AMGX, расположенный в Х-хромосоме, на 6 нуклеотидов короче, в результате делеции первого интрона гена. При ПЦР-идентификации пола, амплифицируются фрагменты обоих аллелей длиной, соответственно, 112 (АМGY) u 106 (AMGX ) пар нуклеотидов.
На электрофореграмме представлены результаты ПЦР-анализа по определению пола эмбрионов. Определите пол каждого эмбриона.
Задание 3. Ген INHα1 ответственен за синтез в яичниках самок ингибина – белка, регулирующего секрецию фолликулостимулирующего гормона (ФСГ). Общая длина второго экзона гена составляет 244 п.н. При его рестрикции Bst образуются фрагменты длиной 25, 85 и 134 п.н. Мутация 769G→A во втором экзоне гена приводит к исчезновению одного сайта узнавания рестриктазы Bst, в результате чего после рестрикции образуются фрагменты длиной 85 и 159 п.н.
На электрофореграмме представлены результаты рестриктного анализа продуктов ПЦР-амплификации второго экзона гена INHα. Нарисуйте схему расположения сайтов рестрикции Bst и определите генотипы исследуемых индивидуумов.
1. Схема сайтов рестрикции Bst второго экзона гена INHα
2. Определение генотипов
-
1
2
3
4
5
6
