II a. Подготовка материала для электронно-микроскопического исследования

Подготовка к электронно-микроскопическому исследованию включает в себя те же этапы, что и при светооптической микроскопии, но с рядом особенностей.

Взятие материала необходимо проводить как можно быстрее, небольшими объемами (не более 1 мм3).

Фиксацию осуществляют, как правило, глутаральдегидом, хорошо стабилизирующим белки, с последующей дофиксацией в тетраоксиде осмия, который стабилизирует фосфолипиды, на холоде в течение нескольких часов. После фиксации материал промывают буферным раствором, обезвоживают спиртами возрастающей концентрации.

Уплотнение и заливку производят с помощью полимеризующейся смеси (эпоксидные смеси). Для этого образцы материала кладут в формы, заливают эпоксидной смолой и помещают в термостат, где происходит полимеризация смолы.

Для приготовления срезов (толщиной 30—50 нм) используют ультратомы, в которых подача блока с объектом на неподвижный нож осуществляется с помощью теплового расширения несущего стержня. В качестве ножей применяют специально приготовленные сколы стекла или алмазов. Получаемые при этом последовательные серийные срезы сползают с ножа в виде лент на поверхность жидкости в прикрепленной к ножу ванночке, откуда их надо перенести на сеточки.

Контрастирование (или окрашивание) срезов проводят с помощью солей тяжелых металлов (свинца, вольфрама, урана). Содержащиеся в этих соединениях элементы с высокой атомной массой осаждаются на фосфолипидах клеточных мембран и не пропускают электронный луч, вследствие чего эти участки клетки выглядят на экране более темными, контрастными по сравнению с другими участками, не содержащими фосфолипидов.

Для ориентировки в изучаемом объекте используют метод изготовления полутонких срезов (1—2 мкм) с последующим окрашиванием (метиленовым синим или толуидиновым синим). Окрашенный срез рассматривают с помощью микроскопа для определения области, которая должна быть изучена на ультрамикроскопическом уровне, и в дальнейшем с этого участка прицельно готовят ультратонкие срезы.

Методика обработки материала для электронно-микроскопического исследования

1. Быстрое взятие материала.

2. Фиксация в 2—4 % забуференном растворе глутаральдегида в течение 1ч.

3. Промывка материала буферным раствором (рН 7,3—7,4) 3 раза по 30 мин.

4. Постфиксация в 1 % растворе тетраоксида осмия в течение 1—2 ч.

5. Промывка материала буферным раствором 3 раза по 30 мин.

6. Обезвоживание в спиртах восходящей концентрации (70 %, 90 %, 100 %) по 10 мин, в 100 % — 2 раза по 15 мин.

7. Пропитывание материала заливочной средой, состоящей из эпоксидных смол, до 24 ч.

8. Заливка материала эпоксидными смолами с добавлением катализатора и последующим помещением его в термостат (60 °С) для полимеризации до 24 ч.

9. Заточка и резка блока.

10. Окрашивание срезов:

а) получение полутонких срезов и окрашивание их метиленовым синим;

б) получение ультратонких срезов с последующим окрашиванием их (контрастированием) раствором уранилацетата (1—2 ч), а затем раствором цитрата свинца (20—30 мин).

Записать или зарисовать в альбом.

1. Требования, предъявляемые к гистологическому препарату

2. Основные этапы приготовления гистологических препаратов.

3. Методы окрашивания и основные типы красителей.

4. Требования при работе с микроскопом.

5. Методы исследования, применяемые в гистологии, цитологии, эмбриологии.

Выполнение самостоятельных контрольных работ.