БИОИНДИКАЦИЯ СОСТОЯНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Биоиндикация - это метод обнаружения и оценки воздействия абиотичееких и биотических факторов на живые организмы при помощи биологических систем.

Обычно живые организмы в той или иной степени реагируют на изменения окружающей среды, но в ряде случаев это нельзя выя­вить физическими или химическими методами, т. к. разрешающие возможности приборов или химических анализов ограничены. Эти­ми методами может быть обнаружен, например, эффект биологи­ческого накопления отдельных токсических веществ в организмах растений и животных. Чувствительные же организмы-биоиндикаторы реагируют не только на малые дозы экологического фактора, но и дают адекватную реакцию на воздействие комплекса факто­ров, выявляя синергизм, эмерджентность, ингибирование

Возможны следующие уровни биоиндикации::

1) Биохимические и физиологические реакции (изменение различных процессов и накопление определенных токсикантов в органах);

2) Анатомические, морфологические, биоритмические и пове­денческие реакции;

3)Флористические, фаунистические изменения.

Следующие три уровня (ценотический, биогеоценотический, ландшафтный) являются предметом более длительных полевых исследований.

Существуют два основных метода биоиндикации: пассивный и активный.

В первом случае исследуют видимые или незаметные повреждения и отклонения от нормы, являющиеся признаками не­благоприятного воздействия, во втором используют ответную реак­цию наиболее чувствительных к данному фактору организмов (биотестирование). Это может быть как один фактор (сернистый газ), так и многокомпонентная смесь (выхлопные газы автотранспорта).

Биоиндикация может проводиться на уровне макромолекул, клетки, организма, популяции, сообщества и экосистемы. В прак­тикум включены работы только на первых четырех уровнях.

Существует биоиндикация специфическая (реакция только на один фактор) и неспецифическая (одна и та же реакция на многие факто­ры). Чувствительными биоиндикаторами могут служить как отдель­ные процессы в клетке и организме (изменение ферментативной активности, накопление аминокислоты пролина, изменения в пигмен­тном комплексе, накопление серы в листьях), так и морфологические изменения (изменения формы и размера листовой пластинки, появле­ние асимметрии, хлорозы и некрозы, уменьшение продолжительности жизни хвои, снижение линейного и радиального приростов).

В порядке возрастания толерантности к загрязнениям раститель­ные организмы располагаются в следующий ряд: грибы, лишайни­ки, хвойные, травянистые растения, листопадные деревья. Среди сельхозкультур наиболее чувствительны салат, люцерна, злаковые, крестоцветные, а к нечувствительным видам относят кукурузу, ви­ноград, розоцветные, подорожник (Рамад, 1981). Следует отметить, что указанные градации не являются одинаковыми для всех видов загрязнителей среды, т. к. их воздействие разное и выявление спе­цифических биоиндикаторов на тот или иной фактор придает само­му методу новый научный аспект, который дает возможность сделать его более точным и информативным.

Методы биоиндикации должны отвечать следующим требованиям: относительная быстрота проведения инди­кации, получение достаточно точных и воспроизводимых результатов, наличие, пригодных для индикации объектов в большом количестве.

Лабораторная работа № 1.

Уменьшение содержания хлорофилла в лис­тьях растений - биоиндикационный признак неблагоприятных условий среды.

Определе­ние хлорофилла фотометрически

Сведения относительно использования содержания хлорофил­ла (и других пигментов) как биоиндикационных признаков, в лите­ратуре противоречивы. Ряд немецких ученых считает этот признак недостаточно информативным и специфичным (Биоиндикация загрязнений... 1988), хотя первой стадией видимых хлорозов листь­ев как раз и является разрушение хлорофилла под влиянием небла­гоприятных факторов. В то же время другие исследователи, в том числе русские и украинские, показали, что у чувствительных к заг­рязнению видов (липы, клена) наблюдается снижение содержания хлорофилла еще до появления видимых изменений и это может слу­жить достаточно надежным неспецифическим биоиндикационным признаком.

Неспёцифичность этого индикатора в том, что недостаток в по­чве азота, а также железа и других элементов, быстро сказывается на окраске листьев в результате разрушения хлорофилла в них и, этот признак очень часто используется для оценки низкого плодо­родия почв. Это надо учитывать и использовать этот показатель при биоиндикации в сочетании с другими признаками.

По нашим данным, для оценки степени загрязнения наземных экосистем или их составляющих листья следует собирать из средней части кроны в первой половине вегетации, учитывая условия произ­растания (освещенность, минеральное питание, обводненность и др.). В качестве биоиндикаторов в городской среде рекомендуется исполь­зовать следующие газочувствительные виды: липу мелколистную, клен платанолистый, каштан конский, ель обыкновенную, сосну обыкновенную.

Метод основан на извлечении хлорофилла из листьев раство­рителями (спирт, ацетон) и определении его количества на фотоэлекроколориметре или спектрофотометре.

Оборудование, реактивы, материалы

1) торзионные весы; 2) фотоэлектроколориметр - ФЭК; 3) насос Камовского или электрический; 4) колба Бунзена с пробкой и стек­лянным фильтром № 2, № 3; 5) ступки малые с пестиками; 6) стек­лянные палочки; 7) ножницы; 8) толченое и просеянное стекло; 9) мерные колбы на 100 и 50 мл; 10) калька; 11) вазелин; 12) фильтро­вальная бумага; 13) медный купорос CuSO₄ 5Н_гО; 14) биохромат калия К₂Сr₂О₇, 15) 7%-ный раствор аммиака; 16) листья растений-ин­дикаторов, собранные в "загрязненной" и "чистой" зонах.

Для учебной работы можно использовать и комнатные расте­ния, выращенные специально в сосудах на гумусной почве с поли­вом водой и на малоплодородной почве с поливом раствором соли какого-либо тяжелого металла.

P.S. В случае отсутствия колбы Бунзена, стеклянных фильтров и насоса, их можно заменить центрифугированием вытяжки хлоро­филла.

Ход работы

Определение хлорофилла в листьях можно проводить как на свежем, так и на фиксированном материале. Фиксацию осуществ­ляют текучим паром (5 мин) или сухим жаром (при 105°С в течение 5—10 мин).

Т. Н. Годнев (1963) предложил следующий способ фиксации для сохранения хлорофилла: листья нарезают мелкими кусочками, за­ворачивают в марлю и погружают в кипящий насыщенный раствор поваренной соли на 1—2 минуты. За это время материал обезвожи­вается и ферменты убиваются. Затем материал промывают текучей водой в течение 0,5 минуты, встряхивают для удаления влаги. Вы­сушивают в тени не менее 2-х суток или в термостате при темпера­туре не выше 40°С. Н. А. Шлык (1971) считал, что лучшие результаты дает сочетание фиксации материала горячим .паром (2 мин) с про­ведением возможно быстрой экстракции на холоде.

При работе с сухим материалом берут навеску 0,5-1 г, со све­жим - 1-2 г. Предварительно определяют влажность листьев. На­веску растительного материала (исключая жилки) тщательно измельчают в фарфоровой ступке с битым стеклом, добавляя мел или углекислый магний. Извлечение хлорофилла из сухого мате­риала можно производить 90%-ным спиртом или 80-85%-ным ацетоном, а из свежего - 96-98%-ным спиртом или абсолютным ацетоном.

К растертому растительному материалу прибавляют немного растворителя и материал продолжают растирать вместе с раствори­телем.

В колбе Вунзена в отверстие пробки укрепляют стеклянный фильтр № 2 или № 3 (диаметр фильтра должен соответствовать количеству исследуемого материала). Колбу соединяют с насосом и производят отсасывание жидкости. Жидкость из ступки слива­ют по стеклянной палочке в воронку-фильтр, предварительно сма­зав вазелином снаружи носик ступки. В ступку приливают 4-5 мл растворителя и вновь растирают в течение минуты, затем опять сливают в воронку. Эту манипуляцию повторяют 2-3 раза, затем переносят на фильтр всю растертую массу, уплотняют ее палочкой и отсасывают. Ступку ополаскивают несколько раз растворителем, выливая его на уплотненный материал в воронку, где ему дают по­стоять 2-3 минуты, после чего отсасывают. Промывание ведут до тех пор, пока стекающий раствор не станет бесцветным. Затем эк­стракт переносят в мерную колбу на 50 мл, ополаскивая несколько раз Бунзеновскую колбу и выливая в мерную. Вытяжку доводят до черты растворителем.

Колориметрирование раствора производят на фотоэлектроколориметре с красным светофильтром. Если жидкость окрашена в интенсивно зеленый цвет, ее необходимо разбавить, так как при больших концентрациях величины на ФЭКе могут выходить за пре­делы разрешающей способности прибора.

Для пересчета хлорофилла на стандартные величины использу­ют раствор Гетри, который готовится следующим образом: 1) 1%-ный раствор CuSO₄ 5Н₂О (берут только синие кристаллы), 2) 2%-ный раствор К₂Сr_г0₇, 3) 7%-ный раствор аммиака (на 7 мл 18%-ного ам­миака надо взять 11 мл воды).

Для изготовления стандарта в мерную колбу емкостью 100 мл точ­но отмеривают растворы (CuSO₄ 5Н_гО - 28,5 мл, К_гСr_гО₇ ~ 50 мл, NH₄OH - 10 мл), доводят дистиллированной водой до метки и пере­мешивают.

Раствор Гетри по окраске колориметрически эквивалентен ра­створу кристаллического хлорофилла по содержанию последнего 85 г в литре.

Методом разбавления стандартного раствора строят калибровоч­ную кривую, где по оси абсцисс откладывают содержание хлорофил­ла (мг/л), а по оси ординат - оптическую плотность. Калибровочную кривую строят от концентрации 0,085 мг/л (1 мл исходного раство­ра и 99 мл воды) до 7,65 мг/л (90 мл исходного раствора и 10 мл воды).

Измерения на ФЭКе производят несколько раз, затем вычисляют среднее. По полученным данным определяют концентрацию хлоро­филла в опытных образцах по калибровочной кривой. Затем вычис­ляют количество хлорофилла в мг/г листа (по сырой или сухой массе). В насаждениях сосны оно колеблется от 0,08 до 0,14 мг/г. Можно так­же выразить количество хлорофилла в процентах (0,3-1,3% абсолют­но сухой массы листа).

Схема записи результатов анализов

Опыт	Навес­ка, мг	Объем вытяж­ки, мл	Показа­ния ФЭКа	Количество хлорофилла по калибровочной кривой мг/50 мл		Содержание хлорофилла в листьях
						мг/г	%

Лабораторная работа № 2.

Накопление фенольных соединений в орга­нах цветковых растений, мхах, лишайниках, как проявление защитной реакции на небла­гоприятные условия среды

Фенольные вещества представляют собой большую и разнооб­разную группу ароматических соединений, чрезвычайно распрост­раненную в растительном мире. На их долю приходится до 2-3% массы органического вещества, а в некоторых случаях - до 10% и более. В отдельных органах растений их количество резко возраста­ет: в сине-фиолетовых лепестках анютиных глазок их 33%, а у садо­вых форм василька - 24% (Блажей, Шутый, 1978; Барабой, 1985; Лебедева, Сытник, 1986).

К группе фенольных веществ относятся флавоноиды (физиоло­гически активные вещества многих плодов, ягод, овощей и дикора­стущих растений). Они делятся на катехины (основные активные вещества чая), лейкоантоцианы (бесцветные вещества, часто пред­шественники флавоноидных пигментов), флавоны и флавонолы (желтые красящие вещества многих цветков), а также антоцианы (синие, красные, фиолетовые пигменты). К полимерным фенольным соединениям относятся дубильные вещества (их много в коре дуба, ивы), лигнин (древесина), меланины (черная окраска цветков и их частей, а также поверхностных покровов насекомых). Халконы и ауроны также придают цветкам желтый цвет или оттенок сло­новой кости.

Одним из возможных путей образования фенольных веществ является их биосинтез из углеводов, образующихся в процессе фо­тосинтеза.

В растениях фенольные вещества несут защитную функцию. Они накапливаются в органах растений при неблагоприятных ус­ловиях среды. Примером этого может служить накопление антоциана и покраснение побегов, почек и молодых листочков у древесных растений на Севере и в высокогорьях (особенно в пе­риод весенних заморозков), а также накопление других групп фе­нольных. соединений у древесных растений осенью и зимой (Барабой, 1984). Фенольные соединения играют большую роль в им­мунитете растений к различным заболеваниям и повреждению на­секомыми. Нередко защитные фенолы у здоровых растений отсутствуют и образуются только как ответная реакция на пора­жение возбудителем (фитоалексины). Фенольные соединения иг­рают важную роль при заживлении механических повреждений, в защите клеток от проникающей радиации, при появлении свободных радикалов, мутагенов, окислителей. Так, в хвое ели повышение содержания фенольных веществ под влиянием сернистого газа на­блюдалось за месяц до повреждения хвои, т. е. явилось как бь предвестником видимых хлорозов и некрозов (Артамонов, 1986).

Флавоноидные пигменты, обусловливающие естественную ок­раску цветов, плодов, ягод, листьев, коры, кроющих чешуи почек обеспечивают привлечение животных-опылителей. Эта группа ве­ществ выделяется в естественную среду из отмерших остатков рас­тений и имеет большое значение в аллелопатии.

Многие защитные фенолы, пройдя генетический отбор, стали неотъемлемым свойством растения (например, преобладание красношишечных форм хвойных в условиях севера и горных систем), в других случаях они появляются в ответ на неблагоприятные усло­вия из своих предшественников-лейкоантоцианов (бесцветных пиг­ментов), которые постоянно содержатся в листьях, коре растений. Так, при недостатке азота листья картофеля начинают продуциро­вать антоцианы.

Накопление фенольных веществ под влиянием неблагопри­ятных и стрессовых условий среды обеспечивает устойчивость вида. Эти вещества выполняют роль защитных барьеров на пути механических, химических, термических факторов среды, а так­же болезнетворных воздействий. Обычно древесная кора, оболоч­ки семян, плодов, ягод, клубней и другие покровные ткани содержат повышенное количество фенольных соединений (ду­бильные вещества, флавоноиды, фенолокислоты) и образуют за­щитный покров, предохраняющий делящиеся клетки (меристемы апикальных частей, камбия) и семена (будущие зародыши жизни) от всякого рода повреждений, препятствуют их проникнове­нию вглубь тканей.

Фенольныё гликозиды клеток мхов, лишайников предотвраща­ют их гниение, а после отмирания способствуют образованию тор­фа. Фенольныё лишайниковые кислоты угнетают размножение многих бактерий и плесеней, поэтому многие лишайники практи­чески стерильны и применялись в северных госпиталях в период Великой Отечественной войны как прокладочный материал при перевязке ран.

Многие фенольныё вещества выполняют фитонцидную роль. Катехины, антоцианы, фенолокислоты и дубильные вещества от­носятся к антибиотикам растительного происхождения. Фитонцид­ный (антибиотический) эффект проявляют и простые фенолы (пирокатехин, гидрохинон, пирогаллол и их окисленные хинонные формы). Так, галлаты (метиловые и этиловые эфиры галловой кислоты), выделенные из плодов клена, угнетают рост туберкулезной палочки, ряда плесеней и грибов, некоторых бактерий, патогенных для растений, обладают противовирусным действием. Всем хоро­шо известно антибиотическое действие фенольных соединений чая, некоторых окрашенных ягод, полыни, календулы и др.

Таким образом, исследования многих авторов показали, что ос­новная функция фенольных веществ - защитная, они накаплива­ются в органах pacтений в неблагоприятных и стрессовых условиях среды и могут служить хорошим биоиндикационным признаком. Ввиду большого разнообразия строения и физико-химических свойств их анализы очень длительны, многоступенчаты и мало при­годны для 2-4-часовой практической работы. Однако для сравни­тельного определения содержания фенольных веществ в раститель­ном сырье существуют более простые методы определения суммы фенольных соединений, которые являются лишь приблизительны­ми, полуколичественными. Тем не менее они нашли широкое при­менение в производственных условиях.

В настоящей практической работе предлагается метод опреде­ления суммы фенольных соединений по Левенталю в модифика­ции А.Л. Курсанова (1937), неоднократно апробированный другими исследователями фенольных веществ. Более точные колориметри­ческие методы определения суммы фенольных веществ требуют применения для экстракции этанола или метанола, что мало при­емлемо для лабораторно-практических работ, однако может быть использовано для дипломных.

Оборудование, реактивы,материалы

1) ступки с пестиками; 2) весы торзионные; 3) стаканчики на 100 мл; 4) водяная баня; 5) чашки испарительные на 800-1000 мл или стаканы такого же объема; 6) бюретки; 7) колбы на 50 мл; 8) ра­створ индигокармина (1 г индигокармина растворяют в 50 мл кон­центрированной серной кислоты и доводят водой до 1 л). Можно приготовить и в меньших объемах; 9) 0,1 н раствор КМпО₄ ; 10) дистиллированная вода; 11) перемолотый растительный материал (ли­стья дуба, клена), собранный в разных экологических условиях.

Ход работы

Навеску в 1-3 г сухого перемолотого или 4-10 г свежего растер­того в ступке с битым стеклом растительного материала нагревают в стаканчике на 100 мл с 40 мл дистиллированной воды в течение 15 мин на кипящей водяной бане при интенсивном перемешивании. Эк­стракт охлаждают, фильтруют и доводят до метки в колбе на 50 мл. Часть полученного экстракта (10 мл) переносят в фарфоровую чашку или стакан объемом 800-1000 мл, добавляют 750 мл дистил­лированной воды и 25 мл раствора индигокармина. Смесь титруют 0,1 н раствором КМпО₄ (3,16 г КМпО₄ в 1 л воды) при энергичном перемешивании. Окончание титрования устанавливают по появле­нию в растворе золотисто-желтого оттенка. Результат титрования умножают на пересчетный коэффициент для перевода миллилит­ров 0,1н КМпО₄ в миллиграммы фенольных соединений, содержа­щихся в 10 мл взятого на титрование экстракта.

Для большей точности параллельно проводят контрольное тит­рование, в котором 10 мл экстракта заменяют 10 мл дистиллиро­ванной воды и полученное значение вычитают из основного определения. В обычной лабораторной практике чаще всего пользуются пе­ресчетным коэффициентом 4,16 (определен для китайского таннина), однако, для анализа чайного листа в нашей стране применяется коэффициент 5,82, а в Индии - 4,62.

Лабораторная работа № 3.

Изменение цвета флавоноидных пигментов различных цветковых растений под влияни­ем рН среды, солей тяжелых металлов

Известно, что яркая окраска цветов, плодов, а иногда и побегов, обусловлена, в основном, пигментами флавоноидной природы, ко­торые входят в обширную группу фенольных веществ, чрезвычай­но распространенных среди растений.

Флавоноиды - гетероцикли­ческие кислородсодержащие красящие вещества, обеспечивающие разнообразную гамму окрасок цветков: красную, алую, фиолетовую, синюю, желтую, оранжевую и смешанные тона - розово-лиловую, лилово-фиолетовую, голубовато-синюю, желто-кремовую, цвета слоновой кости и др. В эту группу красящих веществ входят род­ственные соединения (флавоны, флавонолы, антоцианы, ауроны, халконы, катехины и др.). Некоторые из них широко известны: на­пример, флавонолы чая (кверцетин и рутин), обуславливающие его цвет и физиологическую активность. Среди пигментов наиболее рас­пространены антоцианы (вся гамма расцветок от оранжевого до тем­но-лилового), менее - некоторые флавонолы, ауроны и халконы (цвет от желтого до оттенков слоновой кости).

Присутствие антоцианов помогает интенсивному поглощению световой энергии. Часть ее превращается в тепло, способствуя по­вышению температуры органа. Это является приспособительным свойством растений для лучшего улавливания световой энергии солнца. При этом синие и фиолетовые пигменты поглощают энер­гии больше, чем красные. Вот почему растения с синими и сине-фиолетовыми цветками более распространены в экстремальных условиях Севера и высокогорий.

Яркая окраска цветков способствует их опылению, а у плодов -распространению птицами. Флавоноидные пигменты выполняют также защитную функцию, повышая сопротивляемость растений болезням, устойчивость к неблагоприятным факторам среды.

Предшественниками антоцианов являются бесцветные пигменты-лейкоантоцианы, которые содержатся в листьях, коре, тканях древесины. Некоторые авторы относят к предшественникам выше­указанных пигментов ауроны и халконы (желтые, желто-белые и кремовые оттенки), так как они при некоторых условиях могут пе­реходить в антоцианы. Однако они менее распространены и имеют­ся лишь у отдельных растений, например, в венчике кислицы поникшей, желто-белого львиного зева.

Содержание антоцианов в растениях колеблется в широких пре­делах: от 0,7% до 24% (у красных георгин). В фиолетовых цветках анютиных глазок обнаружено 33% антоцианов.

Название антоциановых пигментов, как правило, дается по на­званию цветка, из которого он был выделен впервые, а цвет зависит от числа гидроксильных групп, метальных или гликозидных остат­ков и других факторов.

Наиболее изучены следующие виды антоцианов:

- красный - пеларгонидин (С₁₅Н₁₂О₆) , который находится в виде гликозидов в цветках герани розовой, васильков, георгин, астр, в ягодах земляники, в кожуре алой редьки посевной, а его предшественник (лейкопеларгонидин) - в эндосперме пшеницы, в кожуре фасоли;

- малиновый - цианидин (С₁₅Н₁₂О₇) - в сложных формах и со­единениях содержится в цветках васильков, роз, астр, тюльпанов, розово-лилового львиного зева, в ягодах брусники, смородины, рябины, в плодах ежевики, малины, вишни, тер­на, листьях бука лесного;

- розово-лиловый дельфинидин (С₁₅Н₁₂О₈) встречается в цвет­ках живокости (дельфиниума), в ягодах черники, винограда, цветках петунии, мальвы, в соке граната, в кожуре сине-фиолетового баклажана, в лепестках пролески лесной, садового гиацинта и др.

Встречаются и другие, менее распространенные группы ан­тоцианов или их производных (геспередин, петунидин, мальви-дин и др.).

Антоцианы имеются почти во всех растительных тканях: в вен­чиках цветков, тычинках, корнях, стеблях и т. д. Во фруктах и овощах они содержатся в эпидермальном слое, а у некоторых сортов вишен, черешен, винограда - и в эпидермисе, и в мякоти. В листьях окраска антоцианов (или их предшественников) часто маскируется хлорофиллом.

В других случаях окраска растений (со сходными оттенками) обусловлена другой большой группой пигментов. Это - каротиноиды, содержащиеся преимущественно в пластидах и обуславливаю­щие гамму расцветок желтого, оранжевого и красного цвета (вспомните цвет календулы - ноготков, а также расцветку осенних листьев). В сравнительно больших количествах каротиноиды содер­жатся в тканях и структурах, связанных с размножением. Это спо­рофиллы и спорангии плаунов, хвощей, папоротников, хвойных, цветковых растений (тычинки и пестики), у которых преобладает желтая, бурая и красная окраски.

Эта группа пигментов распрост­ранена у представителей семейств лютиковых, лилейных, кувшин­ковых, крестоцветных, пасленовых, тыквенных, норичниковых, сложноцветных; они содержатся в листьях крапивы, люцерны, кле­вера, шпината, в кожице красного перца, в плодах абрикоса, ряби­ны, облепихи, апельсинов, мандаринов, хурмы, банана, дыни, томатов, в цветках календулы, нарцисса, одуванчиков. В зеленых растениях каротиноиды часто замаскированы хлорофиллом и по­являются только при его разрушении в период созревания плодов, осеннего расцвечивания листьев, стрессах.

Таким образом, пигментация растений (особенно желто-оран­жевых тонов) очень сходна у двух групп пигментов (флавоноиды и каротиноиды) и полезно было бы их различать. Эти различия сле­дующие.

- Каротиноиды нерастворимы в воде, но растворимы в органи­ческих растворителях (сероуглероде, ацетоне и реже - в спир­те, петролейном эфире, хлороформе). Флавоноиды хорошо экстрагируются горячей водой, этанолом (Методы... 1973).

- Каротиноиды хорошо растворяются в жирах, окрашивая растворы в оранжевый, желтый и красный цвета, флавоноиды - нерастворимы в жирах.

- Каротиноиды устойчивы к щелочам и чувствительны к дей­ствию кислот, флавоноиды реагируют на те и другие. Щелоч­ной дым сигареты часто выявляет антоцианы, образующиеся из своих предшественников.

- Каротиноиды флуоресцируют в ультрафиолетовом свете от слабо-желтого до зеленоватого цвета, флавоноиды светятся голубым, голубовато-зеленым, желтым, желто-зеленым све­том, усиливающимся в парах 2%-ного раствора аммиака.

Фенольные соединения имеют целый ряд специфических ре­акций:

А. При обработке очищенных пятен фенольных веществ на бу­мажных хроматограммах 1-2%-ным спиртовым раствором хлорис­того железа (FeCI₃) появляется сине-зеленоватое окрашивание.

Б. Обработка пятен 1^-2%-ным спиртовым раствором хлористого алюминия (АlO₃) дает фиолетово-голубое, желто-оранжевое, жел­тое, голубое окрашивание (в зависимости от класса веществ) при кратковременном нагревании.

Разнообразие окрасок флавоноидных пигментов в природной обстановке, их изменчивость под влиянием факторов среды побу­дили ученых к выяснению причин этого явления. Было выяснено, что антоцианы и другие окрашенные и бесцветные родственные со­единения (халконы, ауроны, флавонолы, катехины и др.) могут ме­нять свою окраску в связи с изменением условий среды (холодные условия севера, высокогорий, заморозки, недостаток элементов пи­тания, избыток одного из них, изменение рН среды и клеточного сока, стрессы и др.). Так, антоциановое окрашивание различных ор­ганов появляется у растений в неблагоприятных условиях среды, что связано с усилением интенсивности защитных окислительных процессов.

Давно замечено, что фенольные пигменты могут менять свою окраску в комплексе с металлами. Так, обычным цветом для антоцианов является пурпурно-красный, однако в соединениях с Мg, Fe, Al их цвет в лепестках венчиков цветков меняется на голубой. Одной из причин появления интенсивного синего цвета является образование весьма сложных комплексов антоцианов с определен­ными металлами. Природа металла влияет на характер окраски: так, при комплексе с молибденом возникает фиолетовая окраска, с железом - синяя, с медью - белая. В некоторых опытах под влия­нием солей меди окраска лепестков розы и мака менялась на голу­бую и даже черную. Изменение окраски у антоцианов наблюдалось и при разных рН. Так, при рН меньше 6 - окраска карминно-красная, при 6 - фиолетовая, при 8 - синяя, при 10 - зеленая. Кислая почвенная среда вызывает изменение окраски и в природных усло­виях. Так, у герани лесной с синими цветками на кислых почвах - розовые лепестки. Синие лепестки гиацинта, растущего вблизи му­равейника, становятся красными под действием муравьиной кис­лоты. Лепестки примул в парах аммиака приобретают фиолетовую окраску, в парах уксусной кислоты - красную. Спиртовая вытяжка из краснокочанной капусты - красно-фиолетового цвета, при рН = 4-5 - розовая, при рН = 2-3 - красная, при 7 - синяя, при 8 - зеленая, при 9 - желто-зеленая.

Все указанные переходы окраски цветков у антоциансодержащих растений известны, однако усиливающееся загрязнение окру­жающей среды дает нам дополнительную информацию относитель­но индикационного использования этого показателя. Так, в результате выпадения кислых осадков появляются красные или зе­леновато-синие пятна на желтоокрашенных плодах яблок, перси­ков, абрикосов, пурпурные с разными оттенками пятна и точки - на листьях древесных и кустарниковых пород; появляются голубова­то-черные пятна на лепестках отдельных видов растений, произра­стающих в городе, что является предшественником некрозов. По­краснение и побронзовение хвоинок или их кончиков в загрязненной городской среде является признаком их частичного или полного отмирания впоследствии. Особенно сильно такие пятна или крас­новатая окантовка наблюдаются у белых цветков (например, у бе­лых гладиолусов), что обусловлено превращением лейкоантоцианов (бесцветных предшественников) в антоцианы.

В наших опытах водная или спиртовая вытяжка пигментов из розово-белых высушенных лепестков пиона давала с разными реагентами следующие окраски: с H₂SO₄ - яркий карминно-малиновый цвет, с NH₃ - зелено-синий, с FeCI₃ - серо-черный, с HgNO₃ - грязно-черный с сильным осадком, с PbNO₃ - грязно-фиолетовый с появлением осадка и геля. А такие соли как CoSO₄, ZnSO₄, CuSO₄, NiSO₄ не вызвали изменения цвета. Водная вы­тяжка бетацианина красной столовой свеклы давала с уксусной кислотой усиление окраски до карминной, с аммиаком наблюда­лось синее окрашивание.

Слабые кислоты давали изменение и в опытах на целых частях растений: так, наружные листья фиолетовых лука и капусты стано­вились ярко-красными после выдерживания их в слабых растворах серной, соляной или уксусной кислот. Следует отметить, что в опы­тах многих исследователей мало учитывался рН клеточного сока самих растений, хотя установлено, что такие растения, как кислица, щавель, а также молодые иглы хвойных имеют кислую реакцию, а клеточный сок венчиков белых цветов - щелочную, что наверняка должно сказаться на вариациях окраски.

Таким образом, изменение цвета флавоноидных пигментов мож­но использовать как весьма информативный признак, однако обра­зование комплексов антоцианов с металлами в зависимости от физиологических свойств растений недостаточно изучено. В природной обстановке при загрязнении среды видны изменения цвета всего растения или отдельных его частей, а чаще - точечные изме­нения цвета на листьях, плодах и лепестках. Это - локальные реак­ции, вызванные как влиянием локальных загрязнителей (кислые осадки, выбросы автотранспорта, локальные загрязнения тяжелы­ми металлами), так и укусами насекомых при проедании ими ходов в тканях листьев и плодов.

Таким образом, весь комплекс экологических факторов (темпе­ратура воздуха и почвы, влагообеспеченность, рН среды, загрязне­ние почв и воздуха тяжелыми металлами) сказывается на биосинтезе пигментов и этот биоиндикатор может оказаться наиболее инфор­мативным.

Оборудование, реактивы, материалы

1) пробирки в штативе (8-10 штук); 2) стеклянные палочки; 3) медицинские пипетки; 4) ступки малые с пестиками; 5) ворон­ки малые; 6) марля; 7) горячая дистиллированная вода; 8) 5-10%-ные растворы H₂SO₄, HCI, NH₄ ОH; 9) 5%-ные растворы солей тяже­лых металлов: PbNO₃, HgNO₃, FeCI₃, ZnSO₄, CuSO₄, CoSO₄;

10) средне- и слабоокрашенные лепестки цветков, содержащих антоцианы или их предшественники: пиона, мака, розы, герани, (мож­но высушенные); 11) цветущие комнатные растения со средне-или слабоокрашенными цветками, содержащими антоцианы или их предшественники; 12) кусочки лука и капусты фиолетовых сортов.

Ход работы

1) Комочек ваты размером с просяное зерно смачивают в одном из растворов кислот, аммиака, указанных солей, прикрепляют лейкопластырем к листу или лепестку цветущего растения, выдерживают 1-1,5 часа, затем снимают. Реакцию учитывают как во время текущего занятия, так и через одну-две недели;

2) Кусочки лепестков свежих цветков, срезанную чешую фио­летового лука или листья фиолетовой капусты помещают в малую чашку Петри, заливают полностью или частично (в виде накалыва­ния) растворами кислот, аммиака или солей тяжелых металлов, следят за изменением окраски.

3) Лепестки сухих или свежих антоциансодержащих растений заливают горячей дистиллированной водой, чтобы они размякли, растирают пестиком до состояния жидкой кашицы. Выжимают че­рез марлю и разливают по пробиркам, оставив образец раствора для контроля. Добавляют поочередно в каждую пробирку по несколько капель кислот (имитация кислых осадков), аммиака, растворов со­лей тяжелых металлов. Следят за последовательным изменением окраски.

4) Белые, цвета слоновой кости или желтоватые цветки, содер­жащие антоцианы или их предшественники, окуривают парами ам­миака или дымом сигареты, следят за изменением окраски.

Схема записи опытов

Название растений	Ответная реакция по изменению цвета при действии реагентов
	Контроль	H2SO4	HCI	NH4ОН	FeCI3	PbNO3	HgNO3	ZnSO4

Делают соответствующие выводы.

Лабораторная работа № 4.

Определение зольности листьев, хвои, по­чек и коры древесных растений, как индика­ционного признака загрязнения воздушной среды тяжелыми металлами

Исследования, проведенные на древесных растениях показа­ли, что тяжелые металлы, сера и другие элементы накапливаются в органах растений и по их содержанию можно оценить экологи­ческую обстановку как городов, так и более обширных террито­рий, находящихся в зоне загрязнения, по сравнению с контролем (более чистой зоной). Особенно сильное накопление загрязняю­щих веществ наблюдается в зимний период при отсутствий жид­ких осадков.

Это накопление происходит как путем диффузии, так и вслед­ствие связывания тяжелых металлов или их растворимых солей в менее подвижные комплексы с белками, дубильными веществами и др. По процентному содержанию золы, в состав которой входят тяжелые металлы, можно судить об экологическом неблагополу­чии той или иной территории. При достаточном сборе анализиру­емого материала (не менее 10-15 образцов одной древесной породы в одном месте) и статистической обработке можно построить кар­ту-схему загрязнений территории. При этом очень ответственным моментом для построения карты является выбор растений-биоин­дикаторов. Эти растения должны быть достаточно устойчивыми к загрязнителям атмосферы, способными накапливать их в своих органах, быть широко распространеными. Например, в городских экосистемах часто преобладает тот или иной вид тополя, вяза, бе­резы или хвойных (северные города).

Зольность листьев и коры определяют их сухим сжиганием, а затем отделением от зольного остатка, в котором содержатся тяжелые металлы, кремнекислоты и песка.

Оборудование, реактивы, материалы

1)аналитические или точные технохимические весы; 2) разно­весы; 3) муфельная печь; 4) тигельные щипцы; 5) электроплитка с закрытой спиралью; 6) фарфоровые тигли или вьшаривательные чашки; 7) препаровальные иглы; 8) эксикаторы; 9) спирт или дена­турат; 10) дистиллированная вода; 11) хлористый кальций; 12) со­ляная кислота (водный раствор 1:1).

Ход работы

Листья, хвоя или кора древесных растений - биоиндикаторов собирают за 7-10 дней до занятия студентами в различных частях города с целью охватить различные экологические условия, высу­шивают до воздушно-сухого состояния, измельчают и в подписан­ных пакетах сдают лаборанту, который подготавливает их к практической работе, высушивая до абсолютно-сухого веса в тер­мостате при температуре 100-105°С.

Образцы коры и листьев (по 5-10 г) взвешивают, измельчают и озоляют так же, как это изложено в работе № 2 при определении органического вещества методом сухого озоления. После сжигания тигли с золой охлаждают и взвешивают, вычисляют процент золы с песком и кремниевой кислотой. Чтобы определить вес чистой золы в тигель, прибавляют 1 мл дистиллированной воды и 2 мл раствора соляной кислоты (1:1), перемешивают, выпаривают досуха на воз­душной бане и подсушивают при температуре 120-130° С для обезвоживания кремниевой кислоты. К сухому остатку в тигле прибавляют 2 мл раствора соляной кислоты (1:1), 3 мл воды, пере­мешивают, нагревают и фильтруют горячим через беззольный фильтр средней плотности диаметром 7 см в коническую колбу на 100-200 мл или в стакан такой же емкости, промывая тигель и фильтр горячей водой (5 раз по 5 мл), давая каждый раз раствору полностью стечь. В конце процедуры один раз промывают капель­ным способом, направляя капли на края фильтра. Фильтр, на кото­ром находится песок и кремниевая кислота, помещают в тот же тигель, высушивают, прокаливают, охлаждают и взвешивают. Раз­ница между полученной массой и массой пустого тигля дает содержание песка и кремниевой кислоты в навеске. Из полученных дан­ных вычисляют содержание золы по формуле:

100 (А-В)

N

Х =

где:

X - содержание золы (в %);

А - масса золы с песком и кремнекислотой (в г);

В - масса кремниевой кислоты и песка;

N - абсолютно сухая навеска (в г).

Каждый студент исследует какой-либо один объект, а затем все данные группы записываются в общую ведомость или на доске.

Схема записи результатов

Орган – кора

Название пункта взятия коры	Масса, г					Процент золы
	пустого тигля	абсолютно сухой навес­ки с тиглем	тигля с золой	золы	кремниевой кислоты и песка
Центр города
У завода.

Образцы коры и листьев (по 5-10 г) взвешивают, измельчают и озоляют так же, как это изложено в работе № 2 при определении органического вещества методом сухого озоления. После сжигания тигли с золой охлаждают и взвешивают, вычисляют процент золы с песком и кремниевой кислотой. Чтобы определить вес чистой золы в тигель, прибавляют 1 мл дистиллированной воды и 2 мл раствора соляной кислоты (1:1), перемешивают, выпаривают досуха на воз­душной бане и подсушивают при температуре 120-130° С для обезвоживания кремниевой кислоты. К сухому остатку в тигле прибавляют 2 мл раствора соляной кислоты (1:1), 3 мл воды, пере­мешивают, нагревают и фильтруют горячим через беззольный фильтр средней плотности диаметром 7 см в коническую колбу на 100-200 мл или в стакан такой же емкости, промывая тигель и фильтр горячей водой (5 раз по 5 мл), давая каждый раз раствору

Лабораторная работа № 5.

Накопление серы в листьях и коре древес­ных растений в разных условиях загрязне­ния среды сернистым газом

Сернистый газ выделяется в атмосферу при сгорании органи­ческого топлива (уголь, нефть, бензин, газ) за счет разложения со­держащих серу белков, а также от предприятий, перерабатывающих сернистые руды. Мощным источником выделения сернистого газа в городах является автотранспорт.

Некоторые растения в своих органах накапливают те токсичес­кие вещества, которые содержатся в воздушной среде (аккумуля­тивный эффект). При этом проникновение этих веществ в ткани растений может происходить и путем диффузии и активным погло­щением через устьица и покровные ткани. Попавший внутрь листа сернистый газ может включаться в общий метаболизм (образова­ние содержащих серу белков), избыточное же количество сульфат-иона может превращаться в сульфаты (при наличии в коре и листьях

или на 12 часов в более теплом месте. Фильтруют через плотный фильтр (с синей лентой), промытый предварительно кипящей дистиллированной водой, подкисленной соляной кислотой.

Сульфат бария - это очень мелкие кристаллы, которые могут проходить даже через плотный фильтр. Поэтому под дно колбочки, в которую собирается фильтрат, надо положить черную бумагу и на ее фоне следить за чистотой проходящей жидкости. Если на темном фоне обнаруживаются белые кристаллы, фильтрат надо вторично пропустить через тот же фильтр. Если же и при повторном фильт­ровании осадок проходит, то фильтрат подкисляют соляной кисло­той, кипятят и вновь фильтруют после охлаждения. Не следует накапливать много фильтрата в приемнике; при отсутствии следов осадка фильтруют маленькими порциями.

Когда большая часть фильтрата перенесена на фильтр, стенки стакана тщательно и многократно обмывают дистиллированной водой, подкисленной соляной кислотой, потирая их стеклянной палочкой с резиновым наконечником, чтобы вся содержащая серу соль оказалась на фильтре. Осадок промывают до тех пор, пока промывная жидкость уже не будет давать реакции на барий (с сер­ной кислотой).

Воронку с фильтром, закрыв сверху бумагой, помещают в сушильный шкаф или оставляют при комнатной температуре для просушивания. Затем фильтр с осадком помещают в доведен­ный до постоянного веса тигель, озоляют и прокаливают при температуре не выше 700°С, так как при 800°С сульфат бария разлагается. После охлаждения в эксикаторе тигель с осадком взвешивают на аналитических весах. Повторные прокаливания производят до установления постоянной массы. Расчет проводят по формуле:

где:

а - масса BaSO₄;

0,4115 - граммы SO₄ в 1 г BaSO₄;

Р - навеска абсолютно сухого материала, соответствующая взя­тому для определения объему фильтрата.

Если результат выражают в виде S или SO₃, то умножают массу сульфата бария на 0,1373 или 0,3430 соответственно.

Лабораторная работа № 6.

Определение влажности листьев и их тургорного состояния как индикационных при­знаков в условиях уличных посадок городских экосистем

Водный режим растений - один из информативных неспецифи­ческих показателей состояния воздушной и почвенной среды. Из­вестно, что в центральной части любого города создаются зоны, об­разно называемые «островами тепла», где температура воздуха может быть на 6-8°С выше, чем в открытой местности, а относи­тельная влажность воздуха - ниже. Особенно это относится к цент­ральным улицам городов Центра и Юга России, а также Украины. Однако, в северных и западных городах с большим количеством осадков и влажным воздухом водный режим растений как биоин­дикационный признак менее информативен.

На улицах, окаймленных высокими домами, с низкой влажнос­тью почв ввиду стекания выпадающих осадков по асфальтовым по­крытиям или утрамбованному почвогрунту, создаются условия для недостаточного увлажнения корневых систем древесных растений.

Поступившая из корневых систем влага быстро транспирируется древесными растениями и испаряется с поверхности листьев в ус­ловиях повышенных температур и низкой влажности, беспрерывно поступающего потока воздуха вместе с пылью от проходящего ав­тотранспорта. В связи с этим листья теряют тургор и обвисают, из­меняют свою форму из-за аномалий роста, в них наблюдается обезвоживание клеток и часто-вогнутый плазмолиз.

Оборудование

1)секатор со съемными штангами длиной 3-5 м; 2) весы с разновесами; 3) сушильный шкаф; 4) полиэтиленовые и бумаж­ные пакеты.

Ход работы

Данная практическая работа включает в себя два занятия (пер­вое - 2-4 часа, второе - 2 часа).

1. Обследование деревьев на улицах города в жаркий сухой день; у растений-индикаторов (липа, каштан, клен остролистный) учитывается визуально изменение состояния листьев (потеря тургора, обвисание, изменение направления роста у какой-либо части листа).

Одновременно на высоте 4-5 м от основания дерева срезают 30-50 листьев одной породы, растущей в разных экологических условиях

(улицы, закрытые дворы, загородная территория), которые помеща­ют в полиэтиленовые пакеты.

В лабораторий листья быстро перекладывают в бумажные паке­ты (типа больших аптекарских) в трехкратной повторности, подпи­сывают, взвешивают вместе с пакетом.

2. Листья высушивает лаборант при температуре +105°С до по­стоянной массы к следующему занятию. Материал быстро пере­носят в эксикатор, на дне которого находится СаС1₂ (очень гигроскопичное вещество). Затем листья взвешивают в пакете, ос­вобождают пакет и взвешивает его. Вычисляют влажность листь­ев (X) в процентах:

_у а-100

где:

а - масса испарившейся влаги,

в - масса сухих листьев.

Схема записи

Место взятия образца	Масса пакета с сырыми	Масса пакета с сухими	Масса пустого пакета, г	Влажность листьев, %

Делают оценку состояния листьев в разных экологических ус­ловиях и заключение о состоянии окружающей среды в месте взя­тия образцов.

Лабораторная работа №7.

Определение площади листьев у древесных растений

в загрязненной и чистой зонах

Все метамерные органы растений реагируют на загрязнение сре­ды или абиотические факторы. Ростовые процессы у растений вклю­чают в себя множество подпроцессов и фактически являются суммирующими. Растения подвержены очень большой изменчиво­сти (особенно размеры листьев) и диапазон их нормы реакции очень широк. Так, размеры листьев могут сильно увеличиваться после обрезки деревьев, т.к. приток пластических веществ и фитогормо-нов из корневых систем распределяется на оставшиеся после обрез­ки листья, а также стимулирует пробуждение спящих почек. В то же время размер листьев может сильно уменьшаться в результате длительной весенней засухи. В связи с этим при биоиндикации загрязнения наземных экосистем для научных целей требуется ис­ключение указанных вариантов и при взятии листьев нужно при­менять большую выборку (50-60 образцов). В санитарных зонах предприятий, в уличных посадках в большинстве случаев разме­ры листьев уменьшены по сравнению с более чистой загородной территорией. Исключением являются выбросы азотно-туковых заводов, в зоне влияния которых размеры листьев могут быть уве­личены из-за включения азота в метаболические процессы (обра­зование белков и др.).

Существует несколько способов измерения площади листьев. По методикам М.С. Миллера (Летние практические... 1973) - это весо­вой, при помощи светочувствительной бумаги, подсчета квадрати­ков на миллиметровой бумаге, планиметрический. Модификацией весового метода является разработка Л. В. Дорогань-( 1994), где пред­варительно для древесной породы определяют переводной коэффи­циент, а затем путем измерения длины и ширины листа производят массовые вычисления площади листьев. Это значительно ускоряет работу при больших выборках, что необходимо при выполнении дипломных и научных работ, когда в измерения включается боль­шое число образцов.

Оборудование, материалы

1) писчая бумага; 2) ножницы; 3) линейка; 4) весы торзионные или аптекарские с разновесами; 5) листья древесных растений с про­стой и небольшой листовой пластинкой: липы, клена полевого или американского, березы, тополя.

Ход работы

Во время экскурсии по городу (ее разумнее проводить в самом начале сентября) студенты срезают по 20-25 листьев каждой дре­весной породы с деревьев, растущих в разных экологических усло­виях, складывают в пакеты, а затем засушивают между листами газетной бумаги в лабораторных условиях. Это дает возможность провести работу в зимний период.

Установление переводного коэффициента основано на сравне­нии массы квадрата бумаги с массой листа, имеющего такую же дли­ну и ширину. Для этого берут бумагу (лучше в клеточку) и очерчивают квадрат, равный длине и ширине листа, а затем акку­ратно обрисовывают его контур. Вычисляют площадь квадрата бу­маги, вырезают и взвешивают его, затем вырезают контур листа и также взвешивают.

Из полученных данных вычисляют переводной коэффициент по формулам 1 и 2:

К = ——

где:

К - переводной коэффициент,

S - площадь листа (л) или квадрата бумаги (кв),

Р - масса квадрата бумаги или листа.

Вычисление коэффициента производится на основании изме­рения 7-8 листьев. Таким же расчетом он устанавливается отдель­но для каждого вида растений. Примерно он равен для березы - 0,64; для яблони - 0,71-0,72; для тополей - 0,60-0,66.

Затем измеряют длину (А) и ширину (В) каждого листа и умно­жают на переводной коэффициент (К):

S = A ∙ B ∙ K

Получаем ряд значений изменчивости площади листьев для каж­дой древесной породы в разных экологических условиях.

Для каждого ряда вычисляют среднеарифметические величины, сравнивают между собой.

В случае большой выборки строят вариационные кривые встре­чаемости листьев определенной площади в разных условиях среды.

При этом все ряды по площади листьев разбивают на классы от самого маленького листа до самого большого с одинаковым шагом между классами. В учеб­ной работе при наличии 25 листьев достаточно 5 классов. Соответ­ственно По каждому классу производят определение встречаемости. Кривые сравнивают, делают выводы относительно различий в из­менчивости площади листьев в зависимости от экологических ус­ловий. Устанавливают разницу в диапазоне изменчивости для маленьких и больших листьев.

Лабораторная работа № 8.

Обследование состояния придорожных по­садок древесных растений на центральных улицах города (I), в защитных зонах пред­приятий, работающих на органическом топ­ливе (II)

1. Обследование на улицах города. Представленную работу луч­ше проводить в самом начале осени, когда четко видны все повреж­дения листьев на том или ином участке улицы. Это дает информацию о состоянии древесных растений в конце вегетации в разных усло­виях среды. В качестве сравнения очень удобно взять дворовые по­садки, окруженные плотной застройкой без гаражей и автостоянок, а также загородные парки.

Оборудование

1) секатор садовый со штангой для подъема его в крону дере­ва; 2) бумажные пакеты большого размера; 3) морилка для сбора насекомых.

Ход работы

Проводят сбор показателей по следующим параметрам: 1) направ­ление улицы по сторонам света и увязка его с розой ветров; 2) опреде­ление стороны улицы (солнечная, теневая); 3) ширина улицы; 4) тип транспорта (одновременно можно подсчитать загруженность автотран­спортом 5) наличие высоких домов с обеих сторон ули­цы; 6) наличие продувов между домами. (Последние два положения особенно важны, т.к. при плотной застройке и сильной загруженности улиц автотранспортом поток газов и пыли будет ударяться о стены до­мов и возвращаться назад на зеленые насаждения, вызывая тем их по­вышенную повреждаемость); 7) усиленный продув на перекрестках расширенных улиц; 8) наличие стоянок автобусов, автотранспорта, све­тофоров на перекрестках (особенно на узких улицах, т.к. при замедле­нии движения автотранспорта, на холостых оборотах происходит неполное сгорание топлива - сильный выброс токсических веществ); 9) близость зеленых насаждений к дороге (число рядов, номер ряда); 10)вид насаждения (уличная одно-, двух-, трехрядная посадка, сквер, парк, двор); 11) наиболее устойчивые и неустойчивые виды древесных пород.

Оценка состояния самих зеленых насаждений производится по следующим положениям (в обследование должны быть включены не менее 10-15 экземпляров одной древесной породы).

1. Фенологическое состояние (фенофаза). Обычно это состоя­ние сильно различается в загрязненной зоне и в парках.

2. Наличие хлорозов, визуальная оценка процента хлорозной ткани (пожелтение ткани листа вследствие разрушения хлорофил­ла). Отмечается расположение повреждений на дереве (по отношению к дороге, по отношению к поверхности земли - низ кроны, средняя часть, верх кроны).

3. Наличие и процент точечного или краевого изменения пиг­ментации листьев (появление красных, желтых, сине-фиолетовых, синих точек и пятен), вызванного попаданием на листья капелек серной и азотной кислот, солей тех или иных тяжелых металлов. В условиях защитных зон такие изменения может вызвать небольшая утечка радиоактивных веществ (например, в зоне влияния АЭС).

4. Наличие некрозов (отмершей ткани), их процент по сравнению с общей поверхностью листьев. Типы некроза: а) точечный; б) краевой; в) межжилковый; г) идущий лучами от жилок листа. Часто наибольший процент пораженной ткани наблюдается непосредственно у жилок листа, ближе к черешку.

Точечные некрозы возникают вследствие попадания на лист ка­пелек серной или азотной кислот (особенно первой), что возмож­но во время смога, тумана и выпадения на обследуемой территории кислотных дождей: Одно из объяснений образования краевых некрозов - это скопление солей тяжелых металлов по краю листовой пластинки; этим же объясняется отмирание кончиков хвоинок. Межжилковый некроз возникает в результате попадания в лист через устьица либо мельчайших капелек серной кислоты, либо окислов серы, которые в цитоплазме превращаются в серную кис­лоту. Последняя - сильно гигроскопическое вещество - весьма бы­стро отнимает воду от углеводов, которые образуются в процессе фотосинтеза.

С₁₂Н₂₂О₁₁ ^HS04 > 12 С+11Н_гО

В результате образования свободного углерода часть листа (точка или участок) обугливается, свободная вода испаряется, уголь вы­мывается осадками и в результате получается сухая черновато-ко­ричневая ткань (вследствие образования из фенольных соединений опорной ткани листа окисленных форм - хинонов).

В случае, если хлорозы, а потом и некрозы идут лучами от жил­ки листа и их площадь увеличивается к жилке и черешку (что очень наглядно видно у каштана, клена) можно предположить с опреде­ленной долей вероятности, что эти изменения вызваны либо дви­жением токсичных растворов из корневой системы по проводящим путям, либо большой концентрацией этих растворов при ксилемном транспорте.

5. Очень информативным признаком состояния древесных насаждений в городской среде (по сравнению с чистой зоной) являет­ся их поражение фито- и энтомовредителями, т.к. обычно вредители поражают особи, у которых нарушен иммунитет. Так, в условиях средней полосы России даже относительно устойчивые к загазован­ности тополя поражены рядом насекомых, среди которых наиболь­шее распространение имеет минирующая моль. Что касается фитовредителей, то их оценка не однозначна. Так, в модельных опы­тах с выхлопными газами автотранспорта нами было замечено, что процент поражения лиственницы чернью и другими заболевания­ми в условиях загрязнения снижается по сравнению с относительно чистым воздухом (в условиях достаточного увлажнения).

В то же время появились сообщения о поражении каштанов на улицах

гг. Минска и Москвы бурой пятнистостью листьев, которая влечет преждевременное их опадение, ослабление и дальнейшую гибель деревьев. Не исключено, что это заболевание встречается и в уличных посадках каштанов в Черноземье.

6.Полезно срезать секатором листья с той или иной степенью поражения, собрать энтомовредителей в морилку, чтобы более де­тально разобраться в характере и причинах повреждений.

2. В зоне влияния различных предприятий обследование зеленых насаждений производится аналогично. Собирают дополнительные данные о характере и количестве атмосферных выбросов того или иного предприятия, высоте труб, возможной дальности разноса заг­рязнителей в связи с типом климата, преобладающими ветрами и другими факторами.

В результате проведенного обследования и обмена информаци­ей между группами студентов или школьников им дается домашнее

Задание: оформить данную работу, учитывая все выявленные пара­метры, описать на 1-2 страницах картину повреждений и оценить устойчивость различных древесных пород в тех или иных экологи­ческих условиях, обосновать причины выявленных повреждений.

Лабораторная работа № 9.

Определение поражения и омертвления тка­ней листа при антропогенном загрязнении воздушной среды: А) по проценту поражен­ной ткани, Б) по диагностике живых и мерт­вых тканей

Ткани листьев древесных растений, поврежденные в результате антропогенного загрязнения воздушной среды, выбывают из про­цесса фотосинтеза и перестают выполнять свои основные функции: синтеза органических веществ, выделения кислорода и фитонцидов. Ослаблена и их пылезадерживающая роль, т. к. основная масса пыли оседает на слегка влажной поверхности живого листа.

Функция фотосинтеза в огромной мере зависит от площади ли­стовой поверхности (листового индекса). Визуальные методы оцен­ки площади листьев и процента повреждений листовой ткани имеют очень малую точность, хотя в целом и отражают общую картину повреждений.

Предлагаемые методы оценки дают более точное определение пораженной и мертвой ткани, т. к. желтеющая ткань, определенная визуально как живая, может быть оценена как мертвая диагности­ческими методами.

Для объективной характеристики повреждений требуется сбор большого количества листьев (более 50 с каждой точки), точное взя­тие проб, характеризующее всю совокупность, выделение частей дерева по степени соприкосновения с загрязнителями (например, крона дерева направлена в сторону дороги или в противоположную сторону: первый ряд, второй, третий и т. д.).

Для учебных целей достаточно 10-20 листьев с полной характе­ристикой места взятия образца.

Оборудование, реактивы, материалы

А. 1) весы торзионные, 2) линейки, 3) листы кальки.

Б. 1) микроскопы; 2) чашки Петри; 3) бритвы; 4) препароваль­ные иглы; 5) 0,2 н раствор соляной кислоты; 6) теплая вода; 7) ра­створ метиленового голубого (100 мг/л) в 2,5%-ном KH2PO4 или акридиновый оранжевый (200 мг/л); 8) источник ультрафиолета (ультрахимископ «Хроматоскоп»); 9) 10%-ный раствор сахарозы.

При проведении занятий по сокращенному варианту некоторые реактивы могут не потребоваться.

Ход работы

А. Вычисление процента пораженной ткани листа

Собранные листья расправляют, кладут на квадрат кальки, у ко­торого длина и ширина соответствуют размерам листа. Кальку взве­шивают (Р_га), лист очерчивают, по контурам на кальке вырезают его силуэт. Эту часть кальки также взвешивают (Р_л). Определяют пло­щадь листа (S,,):

Применение кальки обусловлено ее прозрачностью, что необхо­димо для дальнейшей работы.

Контуры листа на кальке совмещают с листом и очерчивают все поврежденные участки, вырезают, взвешивают. Вычисляет процент поврежденной ткани:

Диагностика живых и мертвых тканей

Листья выдерживают 20-30 мин в теплой воде (35-37°С) для размягчения ткани, затем помещают на 20 мин в 0,2 н раствор соля­ной кислоты. Мертвые и поврежденные участки побуреют в резуль­тате свободного проникновения кислоты в пораженные клетки и феофитинизации хлорофилла.

Метод окрашивания. Приготавливают срезы разных частей листа, помещают в каплю метиленового голубого в КН^Ю₄. Через несколько минут раствор окрашивает мертвые и нежизнеспособные клетки в синий цвет. Живые клетки окрашиваются значительно медленнее. При окрашивании акридиновым оранжевым через 5-10 мин живые клетки флуоресцируют зелено-желтым светом, а поврежден­ные и мертвые - оранжево-красным.

Флуорометрический метод. Живые ткани в ультрафиолете флуоресцируют обычно слабее, чем мертвые (соответственно голу­бое и желто-розовое свечение).

Плазмолитический метод. Срезы сочных тканей помещают на один-два часа в 10%-ный раствор сахарозы. У мертвых клеток плаз­молиз не наступает, что наблюдают с помощью микроскопа.

Оценивают процент повреждений в разных, экологических ус­ловиях.

Лабораторная работа № 10.

Определение загрязнения окружающей среды пылью по ее накоплению на листовых пластинках растений. Построение карты заг­рязнения территории пылью. Оценка токсич­ности пыли

В условиях городов и других обжитых территорий одним из мощных загрязнителей воздуха является пыль, которая переносит­ся на большие расстояния при распылении почв, при выбросах от цементных, керамических заводов, предприятий по производству силикатного кирпича, а также от движущегося автотранспорта. В последнем случае это мелкие частички почвы и различных солей, продукты снашивания шин и размельчения асфальтового покрытия. Все эти частицы, составляющие пыль, оседают на листьях, вдыха­ются человеком, вызывая нарушение работы дыхательных путей, силикозы, провоцируя кашель и слезотечение. Наибольшее задер­жание пыли листьями отмечено у различных видов тополей, кото­рые распространены в озеленительных посадках городов России и СНГ. Тополя вообще являются наиболее устойчивыми из древес­ных пород к различным типам воздушных загрязнений.

Оборудование, материалы

1)весы торзионные; 2) термостат; 3) калька; 4) вата; 5) пинцеты; 6) фильтровальная бумага; 7) линейки; 8) карта части города; 9) са­довый секатор на сборной штанге; 10) микроскоп.

Ход работы

Листья одного вида тополя, наиболее распространенного в го­роде (черного, бальзамического и др.), отбирают заранее (на отме­ченных по карте местах) с высоты 1,5-3 м (высота слоя воздуха, вдыхаемого человеком) в 10-15-кратной повторности. Для этого используется садовый секатор на сборной штанге. Одновременно отбирают листья тополей, произрастающих в чистой зоне (конт­роль). Листья помещают в пакеты из кальки и осторожно доставля­ют в лабораторию, избегая стряхивания пыли.

Методы определения количества пыли

1. В лабораторных условиях на торзионных или аналитических весах взвешивают кусочек влажной ваты, завернутый в кальку (до 0,001 г). Лист тополя тщательно обтирают этой ваткой с двух сторон (разворачивать кальку следует с помощью пинцета), после чего ват­ку взвешивают в кальке повторно. Массу пыли (Р) рассчитывают как разницу между вторым и первым взвешиванием (Р=Р_г - £,). Пло­щадь листа высчитывают путем обмера листовых пластинок вдоль (а) и поперек ф) и умножением на переводной коэффициент (/с):

S = abk.

Коэффициент колеблется для различных видов тополей от 0,60 до 0,66. Конечный результат выглядит так:

tn = — мг/см²,

где:

т - масса пыли на 1 см² листа.

2. Фильтровальную бумагу смачивают водой до стекания. На нее помещают лист своей верхней, а затем рядом - нижней стороной и прикрывают листом кальки или пленкой. На фильтре получается отпечаток, который оценивают визуально по степени загрязнения (сплошное - 100%, наполовину - 50% и т. д).

Для этих же целей можно использовать липкую пленку «скотч», которую накладывают на лист растения, снимают и приклеивают к белому листу бумаги.

3. Пыль смывают с 30-50 листьев кисточкой в предварительно взвешенную испарительную чашку, воду упаривают, чашку с пылью высушивают в сушильном шкафу при температуре +105°С до по­стоянной массы, а затем взвешивают. Количество пыли рассчиты­вают в мг на см² листа.

Полученные данные заносятся в таблицу

Место взятия	Площадь листьев тополя,	Количество пыли
		мг/см2	% от контроля

Определение токсичности пыли

Сухую пыль растирают стеклянной палочкой в чашке из расче­та 1 г пыли в 25 см³ воды, фильтруют, оценивают токсичность по реакции с простейшими (см. работу № 18).

Построение карты загрязнения пылью определенной территории

Полученные данные по запыленности листьев в разных эколо­гических условиях выписывают на доску, сравнивают с контролем (принимается за 100%). Берут примерную карту района или участ­ка города, на нее наносят данные по загрязнению листьев, сходные по степени загрязнения участки соединяют изолиниями. Раскраши­вают разными карандашами: красный - зона наибольшего загряз­нения, оранжевый - сильного, розовый - среднего, слабо розовый - слабого и зеленый - чистая зона.

Лабораторная работа № 11.

Определение состояния окружающей среды в прошлые годы по радиальному приросту древесных растений

Радиальный прирост древесных растений очень хорошо отра­жает факторы среды. Он относится к неспецифическим призна­кам (прирост одинаково реагирует на разнообразные факторы: солнечную активность, влажность почвы, ее плодородие, засоле­ние, температуру, влажность воздуха и др.). По спилу можно про­следить все серьезные экологические изменения в течение жизни дерева. При изучении прироста одной и той же породы деревьев в одинаковых условиях климата и почв и при достаточной повторности (не менее 25 деревьев) этот показатель может быть доста­точно четким индикационным признаком состояния среды в предыдущие годы.

Годичные кольца нарастают каждый вегетационный период в результате периодической деятельности камбия и состоят из двух частей: ранней древесины (более светлая, откладывается в первую половину вегетации) и поздней (более темная, откла­дывается во вторую половину вегетации). В ранней древесине больше водопроводящих элементов, в поздней - механических. Годичные кольца хорошо видны у хвойных и лиственных кольцесосудистых пород (дуб, ясень и др.). У рассеяинососудистых (береза, осина) они плохо видны. Откладывание различных го­дичных колец древесины характерно для зон с хорошо выражен­ными сезонами года. Во влажных тропиках, где зима и лето по сумме осадков и температурам почти не различаются, заметных годичных колец нет.

При изучении прироста по годам могут наблюдаться следую­щие явления: уменьшение или увеличение ширины годичных ко­лец, их выпадение (полное или частичное), неравномерное отложение древесины по странам света или в связи с условиями среды (большее нарастание древесины в сторону более благопри­ятных условий). При взятии образцов в разных районах Земли ве­личина прироста древесины является весьма специфическим биоиндикатором прохождения циклов солнечной активности, слу­жит для диагностики климатов прошлых лет, особенно в случаях, когда для анализа берутся древесные породы с долгим периодом жизни. Это направление науки называется «дендрохронология».

Оборудование и материалы

1) острый нож, скальпель; 2) измерительные лупы с ценой деле­ния ОД мм; 3) миллиметровка; 4) круглые спилы древесины хвой­ных или лиственных кольцесосудистых (дуб, ясень) пород с корой, взятые из нижней части стволов деревьев в разных условиях произ­растания. Предварительно на них помечают страны света, а также расположение относительно сторон дерева автомобильной дороги, лесного массива, оврага, балки, завода и других местных объектов.

Можно использовать также образцы древесины с годичными кольцами, взятые приростным буравом (керны) от внешних слоев до внутренних. Использование приростного бурава особенно жела­тельно при проведении дипломных и научно-исследовательских работ, т.к. это исключает гибель и порчу деревьев при большом ко­личестве материала и обеспечивает достаточную повторность. Про­сверленное отверстие надо заделывать кусочком пластилина, смолы.

Ход работы

На круговых спилах зачищают древесину в виде бороздок по направлению от края к центру (круглым напильником). Подсчиты­вают возраст дерева по годичным кольцам. Измеряют ширину го­дичных колец, пользуясь измерительной лупой. В случае отсутствия измерительной лупы можно пользовать­ся миллиметровкой, однако измерения будут менее точными. В учебных целях можно пользоваться постоянными зара­нее приготовленными спилами, которые следует отполировать и покрыть лаком (кольца хорошо видны), так как заготов­ка спилов в естественных условиях тре­бует специального разрешения лесных организаций, особенно в пределах зеле­ных зон городов.

Следует отметить, что в северных ус­ловиях и в средней полосе годичные кольца обычно шире с южной стороны чем с северной, в южных засушливых районах – часто наоборот. Но если, например, с южной стороны дерева недавно проложена автодорога, то это может отразиться уже на приросте следующего года, что сразу будет видно на спиле.

Строят графики роста дерева в толщину по годам в зависимости от стран света и экологических условий: выдвигаются различные гипотезы изменчивости роста дерева по годам. График строят сле­дующим образом. По горизонтали размещают хронологическую шкалу - последовательный ряд лет, составляющих возраст дерева. По вертикали откладывают ширину годичных колец в мм. Полу­ченная кривая отражает изменения годичного прироста по конкрет­ным годам и выявляет аномалии этого процесса, обусловленные экологическими факторами (выяснить какими?).

Лабораторная работа № 12.

Определение состояния окружающей сре­ды по комплексу признаков у хвойных

Известно, что на загрязнение среды наиболее сильно реаги­руют хвойные древесные растения. Характерными признаками неблагополучия окружающей среды и особенно газового состава атмосферы служат появление разного рода хлорозов и некрозов, уменьшение размеров ряда органов (длины хвои, побегов теку­щего года и прошлых лет, их толщины, размера шишек, сокраще­ние величины и числа заложенных почек). Последнее является предпосылкой уменьшения ветвления. Ввиду меньшего роста побегов и хвои в длину в загрязненной зоне наблюдается сбли­женность расстояния между хвоинками (их больше на 10 см по­бега, чем в чистой зоне). Наблюдается утолщение самой хвои, уменьшается продолжительность ее жизни (1-3 года в загрязнен­ной зоне и 6-7 лет - в чистой). Влияние загрязнений вызывает также стерильность семян (уменьшение их всхожести). Все эти признаки не специфичны, однако в совокупности дают довольно объективную картину.

Хвойные удобны тем, что могут служить биоиндикаторами круг­логодично. В лесоведении давно разработана оценка состояния ок­ружающей среды по комплексу Признаков у хвойных, при которой используются не только морфологические показатели, которые весь­ма изменчивы, но и ряд биохимических изменений.

Использование хвойных дает возможность проводить биоин­дикацию на огромных территориях (например, оценивать влия­ние на окружающую среду таких гигантов сибирской индустрии, как Норильский и Братский комбинаты).

Хвойные - основные ин­дикаторы, которые применялись для оценки состояния лесов Ев­ропы. Их использование также весьма информативно на малых территориях (например, влияние автодороги на прилегающую зону, если она примыкает к хвойному лесу; состояние окружающей среды в городских экосистемах разного ранга и характера).

Оборудование и материалы

1) весы технохимические; 2) разновесы; 3) линейки; 4) измери­тельные и простые лупы с увеличением в 4-10 раз; 5) миллимет­ровка; 6) термостат; 7) ветви одного вида хвойных, произрастающего в городских посадках или в зоне влияния металлургических пред­приятий, ТЭС и др.; ветви, взятые в относительно чистой зоне заго­родных территорий.

Ход работы

По заданию преподавателя, за неделю до занятий, студенты срезают ветви условно одновозрастных хвойных деревьев, наиболее распространенных в данной местности (напри­мер, для городских условий обычны ель обыкновенная и ель го­лубая колючая). Ветви срезают на высоте 2 м с определенной части кроны, обращенной к зонам с загрязненным воздухом (вблизи автодорог, предприятий, особенно с выбросами в воздух сернистого газа, на который хвойные сильно реагируют). Конт­ролем служат ветви с условно одновозрастных деревьев, собран­ных в чистой зоне заповедника, зеленой зоне города или в посадках лесных культур.

1. Изучение хвои

A. Хвою осматривают при помощи лупы, выявляют и зарисовы­вают хлорозы, некрозы кончиков хвоинок и всей поверхности, их процент и характер (точки, крапчатость, пятнистость, мозаичность).

Чаще всего повреждаются самые чувствительные молодые иглы. Цвет повреждений может быть самым разным: красновато-бурым, желто-коричневым, буровато-сизым и эти оттенки являются информативными качественными признаками.

Б. Измеряют длину хвои на побеге прошлого года, а также ее ширину (в середине хвоинки) при помощи измерительной лупы. Предварительно используя миллиметровку, устанавливают цену деления лупы. Повторность 10-20-кратная, так как биометричес­кие признаки довольно изменчивы.

B. Устанавливают продолжительность жизни хвои путем про­смотра побегов с хвоей по мутовкам.

Г. Вычисляют массу 1000 штук абсолютно сухих хвоинок. Для этого отсчитывают 2 раза по 500 штук хвоинок, их высушивают в термостате до абсолютно-сухо­го состояния и взвешивают.

Д. Сближенность хвоинок. В результате ухудшения роста побе­га в загрязненной зоне пучки хво­инок более сближены и на 10 см побега их больше, чем в чистой зоне. Отмеряют 10 см побега про­шлого года и подсчитывают чис­ло хвоинок. Если побег меньше 10 см, подсчет ведется по суще­ствующей длине и переводится на 10 см.

Во всех случаях измерений выводится среднее.

Схема записи результатов измерений хвои

Место взятия образца	Длина, мм	Ширина, мм	Продол­житель­ность жизни, лет	Число хвоинок на 10 см побега, шт.	Вес 1000 шт., г	Некрозы
						%	ха­рак­тер

2. Изучение побегов

A. Измеряют длину прироста каждого года, начиная от последнего, двигаясь последовательно по междоузлиям от года к году.

Б. Устанавливают толщину осевого побега (на примере двух­летнего).

B. В местах мутовок подсчитывают ветвление, выводится среднее.

Г. На побегах устанавливают наличие некрозов (точечное или другой формы отмирание коры).

3. Изучение почек

А. Подсчитывают число сформировавшихся почек, вычисляют среднее.

Б. Измеряют длину и толщину почек измерительной лупой.

Схема записи результатов измерений побегов и почек

Место взятия	Побеги			Почки
	Длина осевых побегов,	Толщина осевых побегов,	Ветвле­ние, шт.	Число, шт.	Длина, мм	Толщина, мм

Примечание. Для построения карты состояния среды на опреде­ленной территории по реакциям хвойных все биометрические по­казатели выражаются в баллах (самый высокий балл - 5 - в чистой зоне) и наносятся на карту, а затем контурными линиями выделя­ются зоны разной степени загрязнения.

Лабораторная работа № 13.

Оценка состояния окружающей среды по на­личию, обилию и разнообразию видов ли­шайников (лихеноиндикация)

Очень информативными биоиндикаторами состояния воздуш­ной среды и ее изменения являются низшие растения: мхи и лишай­ники, которые накапливают в своем слоевище (талломе) многие загрязнители (серу, фтор, радиоактивные вещества, тяжелые метал­лы). Лишайники очень нетребовательны к факторам внешней сре­ды, они поселяются на голых скалах, бедной почве, стволах деревьев, мертвой древесине, однако для своего нормального функциониро­вания они нуждаются в чистом воздухе. Особенно они чувствитель­ны к сернистому газу. Малейшее загрязнение атмосферы, не влияющее на большинство растений, вызывает массовую гибель чув­ствительных видов лишайников. Они исчезают, как только концен­трация сернистого газа достигнет 35 млрд¹, а среднее его содержание в атмосфере крупных городов свыше 100 млрд¹ (Рамад, 1981). Не удивительно поэтому, что большинство лишайников уже исчезло из центральных зон городов.

Научное направление биомониторинга (т.е. слежения) за состо­янием воздушной среды при помощи лишайников называется лихеноиндикацией.

Лишайники - это симбиоз водоросли и гриба. Они чувствитель­ны к загрязнению среды в силу следующих причин: 1) у лишайни­ков отсутствует непроницаемая кутикула, благодаря чему обмен газов происходит свободно через всю поверхность; 2) большинство токсических газов концентрируются в дождевой воде, а лишайники' впитывают воду всем слоевищем, в отличие от цветковых растений, которые поглощают воду преимущественно корнями;

3) большин­ство цветковых растений в наших широтах активно только летом, когда уровень загрязнения сернистым газом намного ниже (вслед­ствие уменьшения сжигания угля в топках - основного источника сернистого газа), в то время как лишайники обладают способнос­тью к росту и при температурах ниже 0°С.

В отличие от цветковых растений лишайники способны избав­ляться от пораженных токсическими веществами частей своего тал­лома каждый год. В городах с загрязненной атмосферой они редки, главный враг лишайников в городах - сернистый газ. Установлено, что чем выше уровень загрязнения природной среды сернистым га­зом, тем больше серы накапливается в слоевище лишайников, при­чем живое слоевище аккумулирует серу из среды интенсивнее, чем мертвое. Особенно удобны лишайники в качестве индикаторов не­большого загрязнения окружающей среды. Наиболее чувствитель­ным симбионтом в талломе лишайников является водоросль.

В мире насчитывается около 26 тысяч видов лишайников. Они различаются по зонам произрастания (тундра, лесная зона и т.д.), видам субстрата (камни, скалы, стволы и ветви деревьев, почва). У лишайников, растущих на деревьях, видовой состав различается в зависимости от рН коры. Лишайники исчезают в первую очередь с деревьев, имеющих кислую кору (береза, хвойные), затем с нейт­ральных (дуб, клен) и позже всего - с деревьев, имеющих слабоще­лочную кору (вяз мелколистный, акация желтая). В лишайниковых типах леса доминируют кустистые лишайники (кладония, цетрария), длинными бородами с ветвей деревьев свисает уснея, которая является наиболее чувствительным видом и растет в лесах только с чистой атмосферой.

Среди жизненных форм лишайников различают:

1. накипные (слоевище имеет вид корочек) - например, бацидиум фисция;

2. листоватые (слоевище имеет вид пластинок) - например, пармелия, степная золотянка, гипогимния;

3. кустистые (слоевище имеет вид кустиков или свисающих «бо­род», иногда до 1-2 м длиной) - например, уснея, бриория, клафония, цетрария.

Практикуется и более дробное деление жизненных форм лишай­ников:

1. накипные - порошкообразные, слабо структурированные;

2. корковые - коркообразные, плотно прилегают к субстрату;

3. чешуйчатые - коркообразные, края таллома приподнятая;

4. пластинчатые - коркообразные, края бороздчатые и образу­ют лопасти;

5. листоватые - таллом листообразный с четкой нижней коркой;

6. кустистые - прямые волосовидные или кустарниковой формы.

Наиболее чувствительны к загрязнению воздушной среды кус­тистые и листоватые лишайники (исчезают полностью), наименее - накипные.

Лишайники (особенно бриория, пармелия, уснея) являются пи­щей ряда животных (косуль, оленей), а кладония - основная пища северного оленя.

Разрушение и исчезновение лишайникового по­крова в связи с загрязнением территории (например, в условиях Севера под влиянием промышленности и транспорта) нарушает основные пищевые цепи и приводит к исчезновению ряда живот­ных (особенно оленей), которые являются источником пищи и одеж­ды для ряда северных народов.

Ход работы

Биоиндикация территории с помощью лишайников может быть организована по-разному, в зависимости от цели: 1) ознакомитель­ная студенческая практика; 2) сбор материала для дипломной или научной работы.

В одном случае трансекту длиной в 2-3 км удобно разместить перпендикулярно насыщенной автотранспортом загородной доро­ге, примыкающей к лесному массиву, состоящему из небольшого разнообразия древесных видов (например, сосна с примесью бере­зы или дубовое насаждение с примесью клена).

В другом случае трансекта располагается в зависимости от рас­стояния до центра города (центральные улицы, на некотором рас­стоянии от центра, окраинные улицы, загородные территории). Такая трансекта может продолжаться на 20-50 км и переходить в зеленую зону города. Вполне очевидно, что в такой многокилометровой трансекте должны изучаться только виды древесных растений, име­ющиеся на всей территории.

Первая трансекта разбивается на ряд участков: 1) возле дороги, 2) в 100 м, 3) в 300 м, 4) в 500 м, 5) в 1000 м, 6) в 2000-3000 м от дороги. На каждом участке закладываются пробные площади раз­мером 20x20 м, 50x50 м, 100x100 м (в зависимости от цели исследо­вания и разреженности насаждения).

На каждой пробной площади учитываются следующие параметры:

а) общее число видов лишайников;

б) степень покрытия слоевищами лишайников каждого дерева;

в) частота (встречаемость) каждого вида;

г) обилие каждого вида.

При этом могут быть употреблены следующие градации

Оценка	Частота встречаемости	Степень покрытия
1	Очень редкая	Очень низкая
2	Редкая	Низкая
3	Небольшая	Средняя
4	Большая	Большая
5	Очень высокая	Очень большая (встречается на большинстве деревьев)

Ранее отмечалось, что число видов лишайников насчитывается тысячами. Только в бассейне реки Дон в пределах Воронежской об­ласти их обнаружено 243 вида, а на окраинах города Воронежа и в окрестностях - 91 вид. В связи с этим биоиндикация состояния окружающей среды по видовому составу лишайников является пред­метом специальной научной работы, а не практического занятия для студентов и школьников. В кратковременной студенческой прак­тике информативность занятия может быть сокращена до опреде­ления общего количества видов и степени покрытия деревьев.

Влияние загрязнения среды на встречаемость лишайников (составлена по работам многих авторов)

Зона загрязнения	Оценка встречаемости лишайников	Загрязнение воздуха сернистым газом, мг/м3	Оценка загрязнения
1	Лишайники на деревьях и камнях отсутствуют	Больше 0,3-0,5	Сильное загрязнение
2	Лишайники также отсутствуют на стволах деревьев и камнях. На северной стороне деревьев и в затененных местах встреча­ется зеленоватый налет водоросли плеврококкус	Около 0,3	Довольно сильное
3	Появление на стволах и у основания деревьев серо-зеленоватых твердых накипных лишайников леканоры, фисции	От 0,05 до 0,2	Среднее
4	Развитие накипных лишайников -леканоры и др., водоросли плеврококку-са, появление листоватых лишайников (пармелия)	Не превышает 0,05	Небольшое
5	Появление кустистых лишайников (эвернии, уснеи)	Малое содержание	Воздух очень чистый

Лабораторная работа № 14.

Биомониторинг атмосферного загрязнения по реакции пыльцы различных растений-ин­дикаторов

Известно, что наиболее чувствительными процессами, на которые влияют неблагоприятные и стрессовые условия (в том числе и загрязнение среды), являются репродуктивная деятельность и про­должительность жизни растений. При воздействии неблагоприятных факторов могут наблюдаться сдвиги как в мужской (пыльца), так и в женской (семяпочки) сферах. В первом случае это выража­ется в увеличении стерильности пыльцевых зерен, что влечет их пониженное прорастание и уменьшение роста пыльцевой трубки, в результате чего она не достигает семяпочки и не происходит оплодотворение.

Во втором случае гибнет сама семяпочка на первых эта­пах деления после оплодотворения. Известно, чте делящиес клетки обладают высокой чувствительностью к неблагоприятным воздействиям. При очень сильных антропогенных воздействиях (загрязнение воздуха) в семяпочке повышается число мутаций и хромосомных аберраций.

Работы, проведенные разными авторами с различными расте­ниями (табак, мышиный горошек, мать-и-мачеха, подорожник, ку­куруза, сосны обыкновенная и смолистая, пихты белая и сибирская и др.) показали, что в зоне влияния заводов, автомобильных дорог увеличивается число стерильных растений.

Для анализа изготавливают временные давленные препараты пыльцевых зерен; последние обрабатывают ацетокармином по Дженсену (1965). Ацетокармин широко применяется для окраски хромо­сом. В делящихся клетках хромосомы обычно увеличиваются и хорошо видны в микроскоп. Можно окрашивать как проросшую, так и не про­росшую пыльцу (жизнеспособные пыльцевые зерна - красные).

Используют также выявление крахмала у пыльцы (реакция с йодом в йодистом калии), наличие которого показывает ее жизне­способность (синее окрашивание). В ряде случаев окраска может быть от темно-пурпурной до черной. Только что образовавшийся крахмал, который частично гидролизован, будет иметь окраску от красной до светло-пурпурной.

Методика определения всхожести пыльцы и роста пыльцевых трубок предлагается согласно У.Х. Смиту (1985). При сборе пыльцы следует учитывать, что у древесных видов выброс пыльцы происхо­дит относительно быстро: за время от нескольких часов до несколь­ких суток. Собранная пыльца может храниться в холодильнике довольно долго (у отдельных видов хвойных до года и больше).

Попавшее на пестик или овулярный конус зерно пыльцы должно прорасти и образовать трубку длиной в несколько миллиметров, чтобы достичь семяпочки. Многочисленные примеси в воздухе по­давляют развитие пыльцы и рост пыльцевой трубки. При этом многими авторами установлено синергическое воздействие двуокиси : серы и азота, озона и альдегидов на подавление роста трубки. Так, у табака, выращиваемого возле дороги, рост пыльцевой трубки снизился на 89-98%.

Оборудование, реактивы, материалы

1) микроскоп; 2) предметные и покровные стекла; 3) препаро­вальные иглы; 4) чашки Петри; 5) термостат; 6) ацетокармин (реак-тив-1); 7) йод в йодистом калии (реактив-2); 8) агар; 9) 15%-ный раствор сахарозы; 10) пыльца различных растений, собранная в зоне сильного загрязнения воздуха и контроль - в чистой зоне.

Ход работы

Собранная пыльца хранится в холодильнике в малой стеклян­ной таре (бюксы, пробирки) до анализа. Затем ее помещают на пред­метное стекло в каплю ацетокармина, накрывают покровным стеклом и осторожно несколько раз подогревают на спиртовке. По мере испарения красителя его следует добавлять пипеткой под по­кровное стекло. Когда пыльца размягчится (при надавливании пре­паровальной иглой на покровное стекло начинает расплываться) нагревание прекратить. Убрать лишний краситель фильтровальной бумагой. Затем кончиком спички или деревянной палочкой легки­ми ударами по стеклу осторожно раздавить препарат и распреде­лить пыльцу равномерно.

Рассмотреть пыльцу в микроскоп при разных увеличениях; в 100 и 400 раз (10x40). Стерильные пыльцевые зерна с реактивом-1 (аце­токармин) будут белого цвета, а фертильные - красного. Наличие крахмала в пыльце: синяя окраска с реактивом-2 свидетельствует о жизнеспособности пыльцы. При оценке можно ввести такую града­цию: не окрашено, слабо окрашено, сильно окрашено или балльную (от 1 до 4).

Определение прорастания пыльцы и удлинения пыльцевых трубок

Пыльца рано цветущих растений собирается в загрязненной и чистой зонах, высевают на агар в чашки Петри, которые предвари­тельно стерилизуют. Пыльца проращивается в термостате при тем­пературе +25°С - +26°С несколько суток, затем рассматривают в микроскоп с окулярмикрометром. Подсчитывают число проросших пыльцевых зерен. Определяют длину пыльцевых трубок в разных экологических условиях. Подсчитывают процент ингибирования (прорастания пыльцы и удлинения пыльцевых трубок) по сравне­нию с контролем (чистая зона), принятым за 100%.

Пыльцу можно также проращивать на 15%-ном растворе саха­розы, которым смачивается 2-3 фильтра. Пыльца хвойных может прорасти очень быстро (одни сутки).

Приготовление растворов А. Приготовление реактива-1 (ацетокармин)

В стеклянную термостойкую колбу на 100 мл наливают 27,5 мл дистиллированной воды, приливают 22,5 мл уксусной кислоты и насыпают в колбу 1-2 г кармина, затем колбу закрывают неболь­шой стеклянной воронкой и ставят на водяную баню или очень сла­бый огонь электроплитки, подложив под колбу асбестовую пластинку. Раствор медленно нагревают и при слабом кипении вы­держивают 30- 60 мин, охлаждают, фильтруют. Профильтрованный раствор помещают в бутылочку с притертой пробкой, где он может храниться неограниченно долгое время.

Б. Приготовление реактива-2 (йод в йодистом калии)

В 100 мл дистиллированной воды растворяют 2 г йодистого калия, после чего в этом растворе растворяют 0,2 г кристаллического йода.

В. Приготовление 2% агара

В 100 мл дистиллированной воды вносят 2 г агара, нагревают на кипящей водяной бане до полного растворения. Горячий раствор быстро разливают по 20-30 мл в простерилизованные чашки Пет­ри, дают остыть. Стерилизацию чашек Петри можно проводить в сушильном шкафу 30-40 мин, нагревая его до 200°С.

Лабораторная работа № 15.

Определение плодородия почвы по ее цвету и продуктивности растений

Одним из главных признаков плодородной почвы является на­личие в ней гумусовых веществ, которые обусловливают черную, темно-серую и серую окраски. Помимо этих цветов соединения окис­лов железа придают почве красноватый и бурый оттенок, от заки­сей железа формируются голубовато-зеленоватые тона; кремнезем, углекислый кальций, каолинит обуславливают белую и белесую окраску. Эти же тона формируются при наличии в почве гипса и некоторых легкорастворимых солей.

Почву по содержанию гумуса и цвету можно условно разделить

на следующие категории по плодородию

Окраска почв	Содержание гумуса,%	Категории
Очень черная	10-15	Высокогумусная, очень пло­дородная
Черная	7-10	Гумусная, плодородная
Темно-серая	4-7	Среднегумусная, среднепло-дородная
Серая	2-4	Малогумусная, среднеплодо-родная
Светло-серая	1-2	Малогумусная, малоплодо­родная
Белесая	0,5-1	Очень малогумусная, очень малоплодородная

Плодородие почвы можно также определить по продуктивнос­ти растений (методом биотестов). Для объективной оценки плодо­родия почвы надо использовать тесты с разными растениями (не менее трех). Каждый тест проводится в трехкратной повторности. Тестовые объекты - семена пшеницы, овса, ячменя, гороха, вики, редиса и др.

Оборудование, материалы

1) пластмассовые или стеклянные стаканчики объемом 100-150 мл; 2) стеклянные трубочки диаметром 0,8 см; 3) фольга; 4) образцы почвы, взятые в разных местах и сильно различающиеся по цвету; 5) семена различных растений; 6) чистый промытый и прокален­ный песок; 7) образец высокогумусной почвы с известным процен­тным содержанием гумуса (например, 10%).

Ход работы

Образцы почв с разным содержанием гумуса рассматривают при разном освещении, сравнивают с эталонным образцом, определя­ют их категорию согласно вышеприведенной таблице. Затем эти же образцы помещают в пластмассовые или стеклянные стаканчи­ки в трехкратной повторности. Контроль - чистый промытый и прокаленный речной песок. Предварительно перпендикулярно дну каждого стаканчика вставляют стеклянную или пластмассовую трубочку, через которую производят полив почвы одинаковым для опы­тов и контроля количеством воды. Объем почвенных образцов в каждом сосуде - не менее 100-150 г.

За 2-3 дня до опытов (сроки прорастания выясняют заранее) семена пшеницы и других культур замачиваются на сутки в воде, затем раскладывают пинцетом зародышем вверх (в одном направ­лении) в кювету, на дно которой уложен слой гигроскопической ваты, а сверху - два слоя фильтровальной бумаги. Систему увлаж­няют водопроводной водой до полной влагоемкости. Для этого надо налить воду под вату, а после ее впитывания, слить избыток. Кюве­ту накрывают пленкой, края ее подгибают под кювету, систему ста­вят в термостат зародышами на север (это обеспечивает более дружное и ровное прорастание).

Проращивание осуществляется при температуре 26-27°С до раз­мера основной массы проростков 5-6 мм. Затем отбирают одинако­вые проростки (по длине колеоптиля), для чего их предварительно измеряют на кусочке миллиметровой бумаги, на которую положено предметное стекло. Отобранные одинаковые проростки высажива­ют в стаканчики с почвой по 12-13 штук на одинаковую глубину, предварительно сделав палочкой небольшие углубления. Через не­сколько дней, после приживания проростков, их отбраковывают и оставляют 10 штук в стаканчике. Почву поливают одинаковым ко­личеством отстоянной водопроводной воды через трубочки. Ворон­ки для налива воды делают из фольги.

После того как проростки вырастут до размера 8-12 см, их осто­рожно выкапывают из почвы, отмывают водой и обсушивают филь­тровальной бумагой. Затем измеряют длину трубчатого листа и корневой системы отдельно; можно их взвесить.

Плодородие почвы определяют по высоте или массе проростков (по отношению к контролю, который принимается за 100%). Для этого составляется шкала оценок. Почва по плодородию делится на 5 условных категорий:

1. очень бедная, малоплодородная - песок (условная оценка - 100%);

2. почва бедная, малогумусная, малоплодородная;

3. среднегумусная, среднеплодородная;

4. гумусная, плодородная;

5. очень плодородная для данной местности (например, высокогумусный типичный чернозем, горизонт «А»).

Описание результатов опыта. Например, средняя величина про­ростков на песке - 5 см (100%), а на очень плодородной почве - 10 см (200%). Промежуточные градации: 1) величина проростков 6 см (125%), 2) - 7,5 см (150%), 3) около 9 см (175%).

Лабораторная работа № 16.

Определение засоленности почв городских улиц по сухому остатку почвенной вытяжки

Для борьбы с гололедом на городских улицах очень часто при­меняют поваренную соль (NаСl). Под действием соли лед тает, де­лается пористым и нескользким. Однако образующийся рассол разъедает обувь пешеходов, высаливаясь на коже белой полосой, разъедает металлические части автомашин, портит шины. В самой же почве увеличивается концентрация почвенного раствора (осо­бенно у почв с хорошим поглощающим комплексом: черноземы, гли­нистые почвы), что приводит к дефициту доступной для растений влага, нарушает их водный режим. Особенно ярко это проявляется у лип, растущих вдоль дорог. Хлорозы и некрозы листовой плас­тинки у лип под действием солей наблюдаются чаще всего во вто­рой половине лета и начинаются с края листа, постепенно распространяясь на всю листовую пластинку. Живая ткань посте­пенно отмирает и листья преждевременно опадают. Однако это яв­ление не специфично и может наблюдаться и под влиянием других факторов (газовое загрязнение воздуха, ухудшение водного режи­ма почв и растений).

Оборудование, реактивы, материалы

1) весы технохимические или аналитические (для дипломных работ); 2) колбы на 500 мл; 3) воронки; 4) стеклянные палочки; 5) ступки; 6) сито с ячейкой 1 мм; 7) выпаривательные чашки; 8) во­дяная баня; 9) фильтры; 10) сушильный шкаф; И) дистиллирован­ная вода, не содержащая СО_г Для освобождения от СО_г берут 2-3 л дистиллированной воды. Кипятят 30 мин, охлаждают.

Ход работы А. Приготовление почвенной вытяжки

Определяют сначала гигроскопическую влагу почвы и берут воздушно-сухую навеску с учетом этого показателя. Например, в почве содержится 4,56% гигроскопической влаги. Соответственно навеска берется 104,56 или 52,28 г воздушно-сухой почвы (из рас­чета 100 и 50 г) абсолютно сухого образца.

Навеску почвы помещают в сухую колбу емкостью 500-750 мл и приливают 5-кратное количество дистиллированной воды, не со­держащей углекислоты (250-500 г). Колбу с навеской закрывают резиновой пробкой и взбалтывают 5 мин, после чего вытяжку филь­труют через сухой складчатый фильтр. Фильтр помещают в ворон­ку диаметром 15-20 см так, чтобы он лежал на 0,5-1 см ниже края воронки. Нельзя допускать, чтобы фильтр был выше воронки, так как в этом случае по краю фильтра образуются «выцветы» солей и концентрация их в фильтрате снижается.

Перед тем, как вылить вытяжку в фильтр, содержимое колбы встряхивают, чтобы взмутить навеску, и на фильтр стараются пере­нести по возможности всю почву. Это необходимо для того, чтобы частички почвы закольматировали поры фильтра, что способствует увеличению прозрачности фильтрата. При выливании суспензии струю направляют на боковую стенку фильтра, чтобы он не прорвал­ся. Вытяжку профильтровывают до тех пор, пока фильтрат не ста­нет прозрачным. Анализ водной вытяжки начинают после того, как она полностью отфильтруется. Ее количество измеряют мерным ци­линдром. Водные вытяжки анализируют сразу же после их получе­ния, так как под влиянием микробиологической деятельности может изменяться их состав (щелочность, окисляемость). Хранят вытяж­ку в колбе с закрытой пробкой.

Б. Определение сухого остатка вытяжки

Сухой остаток водной вытяжки дает представление об общем содержании в почве растворимых в воде органических и минераль­ных соединений. По величине сухого остатка определяют степень засоленности почв.

50-100 мл водной вытяжки помещают в фарфоровую выпаривательную чашку диаметром 7-10 см (предварительно высушенную и взвешенную). Выпаривают, постепенно добавляя новые порции вы­тяжки. По окончании выпаривания чашку с сухим остатком вытира­ют снаружи фильтровальной бумагой и высушивают в сушильном шкафу при 105°С в течение трех часов, охлаждают, взвешивают. Мож­но высушивание провести на слабо нагретой электроплитке, избегая только прокаливания остатка. Содержание растворимых веществ ха­рактеризуется величиной сухого остатка, выраженной в процентах:

Сухой остаток, % = ———.

50-100 мл водной вытяжки помещают в фарфоровую выпаривательную чашку диаметром 7-10 см (предварительно высушенную и взвешенную). Выпаривают, постепенно добавляя новые порции вы­тяжки. По окончании выпаривания чашку с сухим остатком вытира­ют снаружи фильтровальной бумагой и высушивают в сушильном шкафу при 105°С в течение трех часов, охлаждают, взвешивают. Мож­но высушивание провести на слабо нагретой электроплитке, избегая только прокаливания остатка. Содержание растворимых веществ ха­рактеризуется величиной сухого остатка, выраженной в процентах:

где:

А - масса остатка, г;

Р - навеска почвы, соответствующая взятому объему вытяжки, г.

Для того, чтобы удалить из сухого остатка растворимые органи­ческие вещества, пробы в чашках прокаливают в муфеле при 600°С до белого цвета: 10-15 мин с момента достижения указанной температуры. Если озоление не произошло, то чашку охлаждают, до­бавляют несколько капель дистиллированной воды и снова прокаливают.

Содержание водорастворимых солей в большинстве почв колеб­лется от сотых до десятых долей процента. Засоленными считаются почвы с содержанием солей более 0,2%. Если в почвах содержание солей превышает 1%, то их относят к солончакам.

Лабораторная работа № 17

Качественное определение легко- и средне-растворимых форм химических элементов в почвах городских улиц

Присутствие в почвах легко- и среднерастворимых соединений имеет важное значение. Наиболее вредными для растений солями являются сода (Na _г CО₃)_у хлориды (NaС1, МgС1_г , СаС1_г) и сульфат натрия (Na _г SО ₄), т.е. лепсорастворимые соединения. Легкораство­римые соли, повышающие плодородие почв - нитраты (соли азот­ной кислоты). Из среднерастворимых солей безвредными являются карбонаты кальция и магния, а также сульфат кальция (гипс). Вред­ное влияние на растения оказывает закись железа, а гидраты окиси железа - безвредны. Практически все из этих солей могут встре­чаться в почвах на обочинах дорог и городских улиц, как в силу при­менения противогололедных средств (NaС1, КС1), так и вследствие оседания пыли от эксплуатации дорог и особенно мощного потока автотранспорта, где присутствуют не только продукты сгорания бен­зина, но и продукты амортизации самих машин и дорог.

Оборудование, реактивы, материалы

1) весы с разновесами; 2) колбы на 200 и 100 мл; 3) воронки; 4) стеклянные палочки; 5) фильтры; 6) пробирки; 7) 10% и 37%-ная соляная кислота; 8) конц. азотная кислота; 9) азотокислое серебро - АgNО₃; 10) 20%-ный раствор хлористого бария - ВаС1₂ , 11) раствор дифениламина в серной кислоте; 12) 4%-ный раствор щавелево­кислого аммония – (NH₄)₂ C₂О₄

Ход работы А. Приготовление почвенной вытяжки

Образец ранее приготовленной почвы (растертой и просеянной) взвешивают (25 г), переносят в коническую колбочку на 100 мл, зали­вают 50 мл дистиллированной воды без СО₂ взбалтывают 15 мин, от­стаивают 5 мин, фильтруют через воронку со складчатым фильтром, сливая раствор по стеклянной палочке, наливая каждый раз немного более чем до половины фильтра.

Б. Определение хлор-иона

Берут в пробирку 5 мл водной вытяжки, подкисляют азотной кислотой (1-2 капли) для разрушения бикарбонатов, прибавляют несколько капель азотнокислого серебра, перемешивают. По харак­теру осадка АдС1 судят о содержании хлор-иона.

Характеристика осадка

Осадок	Содержание С/
	мгна 100 мл вытяжки	г на 100 г почвы, %
Большой хлопьевидный	>10	Десятые доли
Сильная муть	5-10	Сотые доли
Опалесценция	1-0,1	Тысячные доли

В. Определение сульфат-иона

Фильтрат водной вытяжки в количестве 2 см³ отливают в про­бирку, добавляют несколько капель концентрированной соляной кислоты и 1-2 см³ раствора хлористого бария. Раствор в пробир­ке нагревают до кипения. При наличии сульфатов происходит ре­акция:

Nа₂SО₄ + ВаСl_г = 2NаСl + ВаSО₄ ↓

Сульфат бария выпадает в виде белого мелкокристаллическо­го осадка.

Характеристика осадка

Осадок	Содержание SO;~
	мг на 100 мл вытяжки	г на 100 г почвы, %
Большой, быстрооседающий на дно	50	Десятые доли
Муть, появляющаяся сразу	10-1	Сотые доли
Медленно появляющаяся слабая муть	1-0,5	Тысячные доли

Г. Определение кальция

Фильтрат водной вытяжки в количестве 3 см³ наливают в про­бирку, подкисляют 1-2 каплями 10%-ной соляной кислоты и добав­ляют 1,5-2 см³ 4%-ного раствора щавелевокислого аммония (оксалата аммония).

При наличии кальция протекает реакция:

СаСl_г + (NН₄)_гС_гО₄ = СаС_гО₄ + 2NН₄С1

Характеристика осадка

Осадок	Содержание Са++
	мг на 100 мл вытяжки	г на 100 г почвы, %
Большой, выпадающий сразу	50	Десятые доли
Муть, выделяющаяся при перемешивании	10-1	Сотые доли
Слабая муть, выделяюща­яся при стоянии	1-0,1	Тысячные доли

Д. Определение нитратов.

В пробирку переносят 2 см³ фильтрата водной вытяжки и по кап­лям добавляют раствор дифениламина в серной кислоте: При нали­чии нитратов раствор окрашивается в синий цвет.

Лабораторная работа № 18.

Определение токсичности сернистого газа, почв, воды, пестицидов методом высечек листьев (по разрушению хлорофилла)

Как ранее упоминалось содержание хлоро­филла в листе - весьма изменчивая величина и с его разрушением связана хлоротичность (исчезновение темно-зеленого цвета и по­явление желтизны). На круглой высечке листа (в большинстве слу­чаев по краям) по мере длительности опыта нарастают хлоротичные и некротические участки. Это явление можно проследить визуаль­но и довольно быстро определить токсичность того или иного ком­понента или их суммы в тех или иных сочетаниях, встречающихся в природе. Инкубация высечек производится на 2%-ной сахарозе (питательная среда для большинства биотестовых испытаний) с добав­лением токсикантов. Контроль - 2%-ная сахароза.

По прошествии определенного времени, которое для разных видов растений и типов листьев различно и требует предваритель­ной апробации, хлорофилл в высечках может быть определен визу­ально по сравнению с контролем, который принимается за 100 процентов, а также инструментально (фотоколоримерически).

Оборудование, реактивы, материалы

1) эксикаторы; 2) фильтры или фильтровальная бумага; 3) чаш­ки Петри; 4) пробочное сверло или гильзы диаметром 10 мм; 5) пин­цеты; 6) пипетки; 7) колбочки на 100 мл; 8) воронки; 9) пузырьки из-под пенициллина или пробирки в штативе; 10) карандаш по стек­лу; 11) Nа₂SО₃, 12) H₂SО₄ 13) 2%-ный раствор сахарозы; 14) пести­цид в концентрации 10³ или 10 ⁴%; 15) загрязненная вода водоема; 16) почва, примыкающая к автодороге; 17) листья растений, нахо­дящихся в стадии вегетации. Все оборудование, материалы стери­лизуются.

Ход работы А. Испытание влияния сернистого газа

На дно эксикатора насыпают Nа₂SО₃, в объеме взятого тигель­ка, возле него устанавливают тигелек с концентрированной H₂SО₄ . На решетчатый круг эксикатора кладут одинаковые куски фильт­ровальной бумаги, смоченной отстоенной водой до полной влагоем-кости, на бумагу укладывают диски (диаметром 2 см) межжилковой ткани листьев нижней стороной вверх, чтобы свободно шел про­цесс поступления газа через устьица, которые располагаются боль­шей частью с нижней стороны листа. Диски высекают пробочным сверлом или гильзой (10 дисков на каждый вариант). Крышку эк­сикатора плотно pакрывают, края крышки предварительно прома­зывают вазелином.

Производят резкое движение эксикатором, чтобы внутри тиге­лек с кислотой опрокинулся на сульфит натрия, отмечают время начавшейся реакции. Реакция проходит по следующему уравнению:

Nа₂SО₃ + Н₂ SО₄ = SО₂ + Nа₂SО₄ + Н₂О

Через некоторое время наблюдается изменение цвета высе­чек листьев различных растений. Эта реакция может быть очень быстрой (у чувствительных видов растений) или более медлен­ной. Выражается она в появлении хлоротичной каемки по краю высечки, отслаивании краешка от фильтровальной бумаги, а за­тем появлении некротической бурой ткани, которая постепенно распространяется на всю высечку. Учитывают время начала хлоро­зов и некрозов, число пораженных дисков (из 10), процент пораже­ния, сравнивают с контролем (взятым за 100 процентов). Контроль ставится с большими повторностями (не менее 30 дисков) в эксика­торе с чистым воздухом. Определение разрушения хлорофилла в дисках листьев можно определить и фотометрически.

Строят кривые поражения листьев сернистым газом по сравне­нию с контролем; на. реи абсцисс откладывают время экспозиции (час), а на оси ординат - процент пораженной ткани у высечек листа.

Количество газа нужной концентрации выше ПДК (см. табл. 3 в приложении), количество реактивов, которые нужно для этого взять, можно рассчитать (Вигоров, 1961). Для этого заранее измеряют объем эксикатора наливанием в него воды мерным цилиндром. Затем рас­считывают, сколько газа необходимо для получения в эксикаторе нуж­ной концентрации, например 0,1% (т. е. по 1 мл газа на каждый литр объема эксикатора). Далее, исходя из того, что одна грамм-молекула газа занимает при Нормальных условиях объем 22,4 л, рассчитывают массу нужного объема газа. Затем, исходя из вышеприведенного урав­нения и молекулярных весов соединений, рассчитывают навеску суль­фита натрия, которые даст требуемое количество газа. Серную кисло­ту для получения газа берут в количестве 2-3 мл. В учебных целях разумнее использовать более высокие концентрации газов (в несколь­ко раз выше ПДК) и непродолжительные экспозиции.

Б. Испытание вытяжки из почвы

Взятые образцы почв (например, одинаковые типы почв под уличными посадками в разных частях города, различающиеся по загруженности улиц автотранспортом) растирают в ступке и просе­ивают через мелкое сито. Взвешивают на кальке 10 г почвы в трех­кратной повторности, пересыпают в колбочку или стаканчик, приливают 25 мл дистиллированной воды. Энергично взбалтывают 10-15 мин на качалке или вручную, оставляют на ночь. Затем жид­кость фильтруют через воронку со складчатым фильтром. Жидкость с колбой стерилизуют в кипящей водяной бане методом погруже­ния и кипячения 10-15 мин, горлышко колбы закрывают фольгой. Охлаждают, затем этой вытяжкой смачивают 2 фильтра до полной влагоемкости. Фильтры стерилизуют вместе с чашками Петри. На фильтры раскладывают диски листьев наземных растений нижней стороной вниз. Повторность трехкратная (по 10 дисков).

Чашки Петри закрывают крышками и ставят в термостат в тем­ноту при температуре +25°С - + 26°С. Наблюдения проводят через 1 сутки утром и вечером каждого дня.

Контролем служат диски, помещенные на чистую простерилизованную воду. Результаты выражают в процентах от контроля, взя­того за 100, или абсолютно (по площади пораженной ткани). График строят так же, как и в опыте с газом.

В. Испытание токсичности загрязненной воды

Взятая для испытаний вода упаривается на водяной бане в 10 раз, ею смачивают 2 фильтра до полной влагоемкости, на которые укладывают диски, высеченные из листьев растений. Чашки Петри с дисками устанавливают в термостат, инкубацию и оценку произ­водят так же, как и в предыдущем опыте. Количество хлорофилла в высечках можно также определить фотометрически.

Г. Испытание пестицидов и других токсических веществ

В качестве токсического вещества нужно взять какой-либо пес­тицид и показать, что разные его концентрации могут проявлять как ингибиторный, так и стимулирующий эффект. Наиболее удобен в этом отношении 2,4 Д, который в малых концентрациях работает как ауксин, а в больших - как гербицид.

Известно, что все пестициды действуют на биоту в миллионных долях процента, поэтому исходный раствор 2,4 Д берется 10³-10⁴ % (0,001%—0,0001%) в 2%-ной сахарозе. Раствор готовят в небольшом объеме (50 мл на группу) и разбавляют затем до нужных концентра­ций. При разведении некоторых пестицидов могут быть определенные затруднения. В связи с этим их лучше развести сначала в небольшом объеме сахарозы (например, в малой испарительной чашке, с растира­нием стеклянной палочкой, а затем разбавить нужным объемом раство­рителя в мерной колбе). Некоторые пестициды старого производства (особенно долго лежавшие) требуют для своего первичного растворе­ния нескольких капель абсолютного или 80%-ного этанола, а потом, после растирания в нем, вводят основной растворитель.

Исходный раствор пестицида (2,4 Д) разливают в пеницилли-новые пузырьки по 5 мл. Последующие растворы приготавливают разбавлением исходного раствора. Например, 1 мл 10³% раствора и 9 мл растворителя - получается 10'⁴% раствор. Каждый взбалтыва­ют, последующий раствор готовят из предыдущего, чем достигают­ся разные концентрации: 10 ^г'%, 10 ⁷%, 10 ¹⁰%.

Растворами смачивают 2 фильтра, укладывают в чашки Петри, на фильтры раскладывают диски листьев наземных растений, чаш­ки ставятся в термостат. Наблюдение и учет вариантов, построение графиков производят согласно предыдущим описаниям.

Следует отметить, что работа с питательной средой, содержащей сахарозу и элементы минерального питания (из почвы и воды) без стерильных условий, чревата искажением результатов из-за бакте­риального загрязнения. В связи с этим питательную среду лучше простерилизовать в автоклаве.

Лабораторная работа № 19.

Биотестирование летучих токсических ве­ществ, воды, вытяжки из почвы, пестицидов по прорастанию семян

Тест на прорастание семян хорошо разработан и очень давно применяется для установления воздействия различных физиологи­чески активных веществ. Биологические пробы применимы и для токсикологической оценки различных компонентов окружающей среды (в том числе и воздушного загрязнения). Так, А. М. Гродзинский и Д. М. Гродзинский (1973) описывают ряд биологических проб для испытания газообразных веществ, которые либо накачиваются в различного типа камеры из емкостей, где они содержатся, либо они выделяются прямо в камеру в результате химических реакций. Этот метод испытан нами и показал хорошие результаты.

Приготовление вытяжек почв, концентрирование воды, разве­дение растворов гербицидов описаны в предыдущей работе. Дан­ную работу можно .расширить за счет использования других токсикантов (например, солей тяжелых металлов), которые в ма­лых концентрациях усиливают ростовые процессы, а в больших -подавляют. К подобным веществам можно отнести и микроэле­менты, которые в растениях и у животных входят в состав фер­ментных систем, а при больших концентрациях проявляют себя как токсиканты.

Обычно используют мелкие семена (льна, кресс-салата, мака, рыжика, укропа и др.). Для достоверной оценки применяют не ме­нее трех тестов с разными видами семян. Лучше использовать све­жесобранные семена, так как на лежалых семенах развивается сапрофитная микрофлора и при прорастании в условиях влажных камер (колбы, чашки Петри, пробирки) они могут загнивать $ вы­бывают из опыта.

С целью профилактики семена протравливают. Сухие семена погружают в 1%-ный раствор марганцовокислого калия на 0,5 часа, а затем промывают дистиллированной водой, используя два слоя марли, обсушивают на фильтровальной бумаге на воздухе.

Приводимый метод оценки токсичности отдельных компонен­тов среды по прорастанию семян апробирован нами не только в лабораторных условиях, но и для оценки степени очистки сточных вод заводов.

Биотестирование сточных вод, идущих на повторное использо­вание, показало, что сточная вода в неочищенном виде подавляет прорастание семян и рост проростков на 22%, после очистных со­оружений - на 12%, а разбавленная в соотношении 1:1 или 1:2 - на 9%. Контроль во всех случаях - отстоянная водопроводная вода.

Оборудование, реактивы, материалы

1) широкогорлые колбы с пробирками; 2) чашки Петри; 3) про­волочки; 4) вата; 5) пинцеты; 6) большие пробирки; 7) пеницилли-новые пузырьки; 8) пипетки; 9) фильтры; 10) карандаш по стеклу; 11) семена тест-растений: кресс-салата, редиса, льна и др.; 12) токси­ческие летучие вещества: аммиак, бензол, ксилол, ацетон, скипидар; 13) водная вытяжка из почвы; 14) загрязненная вода; 15) исходный раствор гербицида (0,001%). Если гербицид плохо растворяется в воде, его предварительно разводят в капельке спирта, а потом разбавляют.

Ход работы

1.На дно широкогорлой колбы помещают вату или фильтроваль­ную бумагу, выделяющие токсические пары тех или иных веществ, которыми они пропитаны. К пробке на проволоке подвешивают шарообразный комок обильно увлажненной ваты, в который пред­варительно вдавливают семена тест-растения. Другую колбу без токсичных паров, но с ватой и семенами, используют как контроль. Ставят обе колбы в термостат при температуре 25-26°С до начала прорастания, а затем выставляют на свет.

Наблюдают за появлением всходов и ростом проростков (число всходов, развертывание листочков), а затем измеряют длину и мас­су каждого проростка.

В большие пробирки на дно помещают источники газообразных токсических выделений (смоченные ватки). Пробирки располагают наклонно, вблизи горлышка каждой кладут сложенный втрое фильтр, который увлажняют 1-2 мл воды и засевают мелкими се­менами мака, салата, рыжика и пр., пробирки закрывают пробками.

Через несколько дней производят оценку прорастания семян и рос­та проростков путем измерения последних.

2. Два фильтра, смоченные 2 мл вытяжки из почвы, или загрязненной водой (в случае очень слабого загрязнения нужна концен­трация воды), или раствором гербицидов (10"⁴-10^в%) помещают на дно чашки Петри, раскладывают на них 50 семян, закрывают крышкой, ставят в термостат при температуре + 25°С - +26°С. Че­рез некоторое время оценивают степень прорастания семян и величину проростков по отношению к контролю, принятому за 100%. Контроль ставят на дистиллированной воде. В научных целях (например, для дипломной работы) оценку производят тогда, когда | семена на контроле прорастут на 50%.

Рабочий раствор гербицида студенты готовят сами из исходного раствора путем последовательного разбавления в пенициллиновых пузырьках или других малых емкостях: к 1 мл исходного раствора (0,001%) прибавляют 9 мл дистиллированной воды, получают 0,0001% и т. д. Следует отметить, что ПДК для пестицидов - это миллионные доли процента. Затем строят диаграммы ингибирования роста семян по отдельным показателям и компонентам: процент прорастания, размер всего проростка, развертывание семядолей и др.

Лабораторная работа № 20.

Биотестирование растворенных токсических веществ по росту отрезков колеоптилей пше­ницы

Биотест с отрезками колеоптилей пшеницы также хорошо раз­работан и основан на растяжении определенной зоны колеоптиля под действием того или иного вещества по сравнению с контролем, который принимается за 100%. Разработан тест для определения аук­синов и ингибиторов; среди последних и фенольные вещества, ко­торые в живом растении чаще всего подавляют рост, а в больших концентрациях (например, сточных водах целлюлозно-бумажных комбинатов) являются токсическими веществами, вызывающими загрязнение питьевых вод. Примером этого может служить загряз­нение вод Ладожского озера и реки Невы.

Нормальный рост колеоптилей осуществляется на 2%-ном ра­створе сахарозы в дистиллированной воде, в котором и растворяют то или иное токсическое вещество. Нами этот метод испытан на раз­личных веществах и вытяжках и показал хорошие результаты инги-бирования (на 20-40% и более). Применение метода дает возмож­ность показать, что действие многих токсикантов двояко: в очень малых концентрациях они стимулируют рост, а в больших - инги-бируют. Так, широко известный гербицид 2,4Д в концентрации ниже миллионных долей (10⁸-10 ⁹%) проявляет стимулирующий эффект, а уже в концентрациях 10⁶-10 ⁷% - ингибирующий.

Помимо колеоптилей пшеницы можно использовать и гипокотили хвойных древесных пород, которые для научных целей также испыта­ны нами с соавторами (Физиолого-биохимические методы... 1977).

Оборудование, реактивы, материалы

1) термостат; 2) кюветы; 3) пинцет; 4) вата; 5) фильтровальная бумага; 6) пленка; 7) бритвы; 8) предметные стекла; 9) пенициллино-вые бутылочки с пробками; 10) чашки Петри; 11) пипетки на 1-5 мл; 12) карандаш по стеклу; 13) миллиметровка; 14) испытуемые веще­ства: вода, исходный раствор гербицида; 15) 2%-ный раствор саха­розы; 16) семена пшеницы.

При индивидуальной работе можно использовать для нарезки отрезков колеоптилей специальный станочек, в котором выточены бороздки для укладывания ростков. Уложенные ростки зажимают с двух сторон резинками. Затем в поперечные бороздки, сделанные через 5 мм, вставляют бритву и нарезают очень быстро 10-12 штук отрезков колеоптилей. При нарезке можно использовать специаль­ный резачок. При отсутствии резачка используют миллиметровку, покрытую стеклышком, и бритву.

Ход работы Предварительная работа

До проведения практического занятия подготавливают ростки пшеницы. Для этого хорошо всхожие семена замачивают на 18-20 ча­сов в воде, а на другой день раскладывают пинцетом в кюветы зароды­шем вверх и в одном направлении на слой мокрой ваты (2-3 см), на которую помещают два слоя фильтровальной бумаги. Вату увлажня­ют до полной влагоемкости, что легко регулировать, сливая осторож­но излишки воды через край кюветы. Кювету закрывают пленкой, подгибая ее края под дно кюветы, а затем ставят в термостат при тем­пературе 25-27°С зародышами на север, что обеспечивает более ров­ное прорастание.

Проростки проращиваются до среднего размера 1,5—2,5 см (не более), т. к. большие проростки теряют чувствительность. Для установления нужного времени замачивания и проращивания предварительно проводят пробные работы, т. к. на эти процессы влияют многие переменные: сорт пшеницы, всхожесть, размеры семян и время года. Наш многолетний опыт показал, что в про­цессе прорастания семян существует определенная периодич­ность, обусловленная генетически и внешние факторы играют здесь второстепенную роль. Так, семена почти всех растений, не требующих стратификации, дружно и быстро прорастают в ве­сенний период, хуже - в осенний и очень плохо - в период глу­бокого покоя (с половины ноября до половины января).

Практическая работа

Из исходного раствора гербицидов или других испытуемых ве­ществ приготавливают серию растворов на 2%-ной сахарозе мето­дом последовательного разбавления. Последний из растворов должен быть ниже ПДК (для гербицидов меньше 10"⁶%). Сделать вытяжку из почвы: 10 г растертой почвы заливают 25 мл дистилли­рованной воды, сильно взбалтывают 10-15 мин, отстаивают, филь­труют через воронку. Можно также взять для биотестирования воду реки, водохранилища.

Ростки пшеницы срезают у основания бритвой или пинце­том с заточенными кончиками, складывают в чашку Петри. Ис­пользуя миллиметровку и предметное стекло, разделяют колеоптили на фракции: 1,5-2 мм, 2-2,5 мм и работают на пре­обладающей фракции. Затем от колеоптиля бритвой отсекают кончик 0,5 мм, вырезают следующие 5 мм - зону растяжения, и помещают на 10—15 мин в чашку Петри с дистиллированной во­дой для удаления ауксинов и лучшей реакции на испытуемое ве­щество. Через указанное время вырезанные зоны колеоптилей помещают (по 10 шт.) в пенициллиновые бутылочки с испытуе­мым раствором, которые закрывают резиновыми пробками. Повторность опытов - трехкратная. Пенициллиновые бутылоч­ки осторожно поворачивают набок, отрезки колеоптилей расправ­ляют так, чтобы они все плавали в растворе. В таком состоянии их помещают в термостат при температуре +25°С - +26°С на 2-3 дня (в учебных целях - на неделю).

Через указанные сроки снимают результаты измерения длины отрезков колеоптилей. Рост их на чистой 2%-ной сахарозе прини­мается за контроль (100%), реакция же на испытуемые растворы подсчитывается относительно контроля.

Строится гистограмма ингибирования (а в отдельных случа­ях и стимулирования) роста отдельными токсическими веще­ствами,или их смесями (вытяжка из почвы, вода) в разных разведениях.

Лабораторная работа № 21.

Биотестирование токсичности субстратов по проросткам различных растений-инди­каторов

Предлагаемый метод биологической оценки субстратов или ра­створов проводится в трех вариантах:

I. Выращивание растений на субстратах, токсичность которых надо оценить (почва, вода).

И. Полив проростков испытуемыми растворами (вытяжка из почвы или сточные воды различных предприятий) с той или иной степенью их концентрации и очистки.

III. Накалывание испытуемого раствора между семядолями дву­дольных растений.

В первых двух вариантах применяют самые различные тест-ра­стения (в зависимости от поставленной задачи): пшеница, овес, яч­мень, проростки древесных пород.

В качестве тест-растений в третьем варианте используют только проростки двудольных: кресс-салата, салата майского, ре­диса и др.

В связи с длительностью выращивания большинства тест-рас^ тений (исключая пшеницу, овес и др.) указанные методы имеют ог­раниченное применение для учебных лабораторных работ, однако они дают очень хорошие результаты в оценке токсичности тех или иных субстратов при выполнении курсовых, дипломных, а также научно-исследовательских работ.

Следует отметить, что все результаты испытаний с тест-расте­ниями должны быть подвергнуты статистической обработке.