Механизмы генетической рекомбинации бактериальной днк: трансформация, трансдукция, конъюгация

Прокариотам несвойственно половое размножение. Рекомбинация у них происходит в результате внутригеномных перестроек, заключающихся в изменении локализации генов в пределах хромосомы, или при проникновении в клетку реципиента части ДНК донора.

В результате рекомбинаций образуется только один рекомбинант, генотип которого представлен в основном генотипом реципиента с включенным в него фрагментом ДНК донора.

Генетические рекомбинации происходят при участии ряда ферментов в пределах отдельных генов или групп сцепленных генов. Существуют специальные гес-гены, детерминирующие рекомбинационную способность бактерий. Передача генетического материала (хромосомных генов) от одних бактерий к другим происходит путем трансформации, трансдукции и конъюгации. Передача плазмидных генов - путем трансдукции и конъюгации.

Трансформация - изменение одного типа клеток при действии активного начала из другого типа клеток. Феномен открыл Гриффит у Streptococcus pneumoniae (1928); позднее Эвери, Маклеод и Мак Карти (1944) выделили трансформирующее начало пневмококков в форме молекулы ДНК. Это и явилось первым прямым доказательством того, что носителем генетической информации является ДНК.

Погибшие бактерии постоянно высвобождают ДНК, которая может быть воспринята другими бактериями. Традиционно, любая чужеродная ДНК, попадающая в бактериальную клетку, расщепляется эндонуклеазами. При некоторых условиях такая ДНК интегрируется в геном бактерий и изменяет его. Встраивание плазмидной ДНК может менять вирулентность бактерий. В обмене генетической информацией трансформация играет незначительную роль.

Трансдукция - перенос фрагмента ДНК от одной клетки (донора) к другой (реципиенту) с помощью бактериофага. Явление открыл Ледерберг и Циндер (1952). Выделяют 3 типа трансдукции:

1. неспецифическая (общая) - в клетке, инфицированной бактериофагом, в ходе сборки дочерней популяции в головки некоторых фагов вместе с вирусной ДНК может проникнуть любой фрагмент бактериальной ДНК или плазмиды. В этом случае, фаг утрачивает часть своего генома, становиться дефектным и способен вызвать трансдукцию. При такой форме трансдукции в клетки-реципиенты могут быть внесены практически любые гены.

2. специфическая характеризуется способностью фага переносить определенные гены от бактерии-донора к бактерии-реципиенту. Это связано с тем, что образование трансдуцирующего бактериофага происходит путем выщепления профага из бактериальной хромосомы вместе с генами, расположенными на хромосоме в клетке-донора рядом с профагом. При взаимодействии трансдуцирующих фагов клетками реципиентного штамма происходит включение гена бактерии-донора вместе с ДНК дефектного фага в хромосому бактерии-реципиента. Бактерии, лизогенированные дефектным фагом, невосприимчивы, как и все лизогенные клетки, к последующему заражению гомологичным вирулентным фагом.

3. абортивная. Принесенный фагом фрагмент ДНК бактерии-донора не включается в хромосому бактерии-реципиента, а располагается в ее цитоплазме и может в таком виде функционировать. Во время деления бактериальной клетки трансдуцированный фрагмент ДНК-донора может передаваться только одной из двух дочерних клеток, т. е. наследоваться однолинейно и постепенно утрачиваться.

Конъюгация - перенос генетического материала их клетки-донора в клетку-реципиента при их скрещивании. Процесс конъюгации у бактерий впервые обнаружен Д. Ледербергом и Э. Тейтумом в 1946 г. Позднее выяснилось, что донорами генетического материала являются клетки, несущие F-плазмиду (половой фактор). При скрещивании F⁺ с F" клеткой половой фактор передается независимо от хромосомы донора, если плазмида находится в автономном состоянии. При этом почти все реципиентные клетки получают F плазмиду и становятся F⁺ клетками.

Этапы коньюгации:

1. прикрепление клетки-донора к реципиентной клетке с помощью половых ворсинок (sex pili).

2. образуется конъюгационный мостик, через который из клетки-донора в клетку-реципиент могут передаваться F-фактор и другие плазмиды, находящиеся в цитоплазме бактерии-донора в автономном состоянии.

3. Интеграция F-плазмиды в состав бактериальной хромосомы приводит к разрыву одной из нитей ДНК, что обеспечивает возможность переноса в реципиентную клетку.

Постановка опыта трансдукции

Умеренный фаг, полученный при фильтровании из культуры E.coli в объеме 1 мл вносят в стерильную пробирку, затем в эту пробирку вносят 1 мл бульонной культуры E.coli, не способной расщеплять лактозу. Опытную пробирку выдерживают в термостате 40 мин. Затем делают высевы на сектора чашки со средой Эндо: умеренный фаг; E.coli lac-; из опытной пробирки.

Постановка опыта конъюгации

В отдельную стерильную пробирку вносят бульонную культуру донора и бульонную культуру реципиента в объеме по 1 мл. Опытную пробирку выдерживают в термостате 40 мин. Затем производят высевы культуры донора, реципиента и смесь донора с реципиентом на отдельные сектора минимальной питательной среды. Инкубируют 24 часа 37°С.

Самостоятельная работа: учесть результат опыта. Зарисовать. Сделать вывод о практическом значении данного явления

Ход исследования

а) умеренный фаг, полученный при облучении УФ лучами Е. coli лак+ (донор);

б) культура Е. coli лак- (реципиент);

в) среда Эндо, как селективная среда с лактозой для выявления рекомбинантов Е. coli

Получение трансдуцирующего фага

Реципиент E.coli(лак-)

Донор. E.coli (лак+) чистый б/ф

Облучение рекомбинаты

Фильтрация

Чистый бактериофаг

МПБ 37°, 40-60

Среда Эндо

Вывод:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Работа № 4. Аттенуация. Живые аттенуированные вакцины

Цель: разобрать принципы получения живых вакцин.

Теоретическая справка

Живые аттенуированные вакцины. Принципы аттенуации.

Современная генетика интенсивно изучает молекулярно-генетические основы патогенности и иммуногенности микроорганизмов, механизмов образования новых биологических вариантов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, распространением антибиотикорезистентных штаммов на фоне расширяющегося арсенала химиотерапевтических средств. Большое внимание уделяется получению микроорганизмов со сниженной вирулентностью и сохраненной иммуногенностью - вакцинных штаммов.

Название «вакцина» было дано Луи Пастером всем прививочным препаратам, полученным из микроорганизмов и их продуктов. Э. Дженнером была получена первая живая вакцина, содержащая вирус коровьей оспы (vaccinus - коровий), идентичный по антигенным свойствам вирусу натуральной оспы человека, но маловирулентный для человека, т. е. данная вакцина была заимствована из природы. В России применяется другая вакцина, заимствованная из природы - сибиреязвенная вакцина СТИ, названная в честь сотрудников санитарно-технологического института г.Ленинграда, выделивших из почвы бескапсульный вариант бактерий сибирской язвы. Заслугой Луи Пастера была разработка принципов направленного получения аттенуированных вакцинных штаммов -селекция спонтанных мутантов с пониженной вирулентностью и сохраненными иммуногенными свойствами путем культивирования их в неблагоприятных условиях; пассирования через организм устойчивых к данной инфекции животных; куриный эмбрион; культуру клеток; длительным воздействием бактериофага; ультрафиолетовых, рентгеновских лучей.

Антирабическая вакцина получена Л. Пастером в результате 133 пассажей уличного вируса бешенства через мозг кроликов.

Чумная вакцина EV получена Г. Жераром и Ж. Робиком при культивировании чумных бактерий при температуре 16°С в течение 5 лет.

Вакцина БЦЖ получена А. Кальметтом и Ш. Гереном при длительном культивировании микобактерий туберкулеза бычьего типа на глицериновом картофеле с желчью. Желчь явилась фактором, неблагоприятным для микобактерий, что привело к ослаблению вирулентности этого штамма.

Бруцеллезная, туляремийная вакцины были получены при культивировании на картофельной среде в течение 5 лет.

Вакцина против вируса желтой лихорадки была получена 238 пассажами на белых мышах.

Сыпнотифозная вакцина получена при длительном пассировании на КЭ.

Вакцины против гриппа, кори, краснухи, полиомиелита, паротита получены под воздействием различных факторов - азотистая кислота, гидроксиламин, бромзамещенные основания, повышение температуры, понижение рН среды, ультразвук, ультрафиолетовые лучи, нуклеазы на КК.

Современная биотехнология приготовления вакцин включает ряд этапов: накопление значительных количеств микробной массы или токсина на специальных питательных средах при оптимальных температурных и других условиях при постоянной аэрации, а для анаэробов при отсутствии кислорода. Большинство вакцин высушивают из замороженного состояния в глубоком вакууме - лиофильная сушка. Это обеспечивает их длительное хранение.

Самостоятельная работа: записать предложенные вакцины с указанием методов аттенуации (см. теоретическую справку)

Название вакцины	Методы аттенуации
Оспенная
Сибиреязвенная СТИ
БЦЖ
Туляремийная
Бруцеллезная
Чумная E.V.
Против вируса желтой лихорадки
Антирабическая
Гриппозная
Сыпнотифозная
Полиомиелитная
Коревая
Краснушная
Паротитная

Результат:_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Подпись преподавателя_______________________________________________________