5.6. Визначення протеолітичної активності.

Важливим етапом технології багатьох харчових виробництв в біохімічні перетворення білків, які відбуваються під дією протеолітичних ферментів. В основі визначення протеолітичної активності лежать різні принципи: зміна фізико-хімічних властивостей субстратів, визначення зменшення субстрату, облік кількості продуктів протеолізу.

Контроль за зменшенням субстрату дозволяє судити про активність протеїназ, оскільки при цьому визначається кількість непрогідролізованого білка. Тому метод можна використовувати для препаратів, які застосовуються в різних галузях промисловості.

Принцип методу полягає в гідролізі казеїну відомою кількістю ферментного препарату і визначенні ступеня розщеплення білка за зменшенням кількості соляної кислоти, що зв'язується непрогідролізованим казеїном. Після ферментної дії протягом 1 год. у досліді і перед доданням такої ж кількості ферментного екстракту в контролі ферментативну реакцію зупиняють 0,1 н. розчином соляної кислоти. Осади фільтрують, а 10 мл фільтрату титрують 0,1 н. розчином NaOH. Кількість NaOH, що пішла на титрування в дослідній та контрольній пробах, береться за міру протеолітичної активності об'єкта, що піддають аналізу.

Цей метод є досить простим і зручним у роботі. За одиницю активності прийнята кількість ферменту, яка за 1 год. при 30°С каталізує гідроліз 1 г казеїну.

Хід роботи. У колби (плоскодонні чи конічні) на 100 мл набирають піпеткою по 20 мл розчину казеїну і занурюють у водяну баню з температурою 30С. Через 10 хв. в них наливають при помішуванні 10 мл ферментного розчину. Весь об'єм (казеїн і ферментний розчин) повинен бути 30 мл. Якщо на аналіз береться менше 10 мл ферментного розчину, недостатній до 30 мл об'єм заповнюється дистильованою водою, яку приливають перед введенням ферменту. Рівно через годину в колби приливають (теж при помішуванні) піпеткою 20 мл 0,1 н. розчину соляної кислоти в 7,5%-му сульфаті натрію та фільтрують до повної прозорості (повертаючи фільтрат на той самий фільтр). Контроль (два паралельні визначення) ставлять таким самим чином: до введення ферментного розчину додають суміш соляної кислоти з 7,5% сульфатом натрію і колби не витримують на водяній бані, а відразу фільтрують. У 20 мл фільтрату контролю та досліду відтитровують надлишок соляної кислоти 0,1 н. розчином гідроксиду натрію. Титрують у присутності двох краплин 0,5%-го спиртового розчину крезолроту до червоного забарвлення. Різниця титрувань (дослід – контроль), перерахована на 10 мл фільтрату, може становити 0,4–2,5 мл. Якщо вона менша за 0,4 чи більша 2,5 мл, то аналіз повторюють з більшою чи меншою дозою ферменту, змінюючи кількість ферментного розчину або його розбавлення.

Розрахунок активності. За різницею титрувань досліду і контролю в мл 0,1 н. гідроксиду натрію, яку перераховують на 10 мл фільтрату, знаходять одиниці активності за табл. 5.3. У табл. 4.3 наведені також значення протеолітичної активності за умов, що на аналіз було взято 10 мл ферментного розчину в розбавленні 1:100 чи 1:50.

Для інших кількостей ферментного розчину чи інших розведень протеолітичну активність перераховують за формулою:

де е – кількість одиниць, знайдена по таблиці згідно з результатами титрування; а – наважка препарату (г, мл), яка відповідає 10 мл фільтрату (1) 5 всієї кількості, взятої на аналіз).

Приклад розрахунку.

1. Для аналізу брали 10 мл ферментного екстракту 1:50. На титрування досліду витратили 4,2 мл 0,1 н. розчину гідроксиду натрію, на титрування контролю – 2.0 мл. Різниця титрувань перерахована на 10 мл фільтрату (4,2 – 2,0) : 2 =1,1мл 0,1 н. розчину гідроксиду натрію. Величина 1,1 відповідає за таблицею 5.3 ПА = 1,868.

2. Для аналізу брали 5 мл розчину очищеного препарату 1:1000., Різниця титрувань досліду і контролю дорівнює 1,8 мл 0,1 н. розчину гідроксиду натрію. Величина 1,8 дорівнює за таблицею 0,1353 од., визначаємо "ПА".

В 5 мл розчину 1:1000 міститься 0.005 г ферменту. Ці 0,005 г містяться в 50 мл реакційної суміші, а в 10 мл ферменту – 0,001 г

Одержані величини активності округлюють: для культур і сиропів – до 0,01, а для очищених препаратів – до 0,1.

Реактиви: 1. 5%-й лужний розчин казеїну: 50 г (за сухою речовиною) технічного подрібненого казеїну вносять в склянку, додають для набрякання 50 мл дистильованої води та залишають на 30 хв., потім склянку поміщають на водяну, баню з температурою 65–70°С. Поступово, при ретельному помішуванні скляною паличкою, додають 50 мл 1 н. розчину гідроксиду натрію. В процесі розчинення казеїну додають невеликими порціями воду (5–6 разів по 50–80 мл), нагріту до 65–70°С, та витримують на бані до повного зникнення згустків. Після повного розчинення казеїну та охолодження об'єм розчину доводять в мірній колбі до 1 л фільтрують через чотири шари марлі; 2. 0,1 н. розчин соляної кислоти в 7,5%-му розчині сульфату натрію; 3. 0,1 н. розчин гідроксиду натрію; 4. індикатор – 0,5-й спиртовий розчин крезолроту; 5. розчин ферменту (див. методику визначення амілолітичної активності).

Таблиця 5.1. Протеолітична активність

(перерахунок на повітряно-суху речовину)

0,1 н NaOH, мл, на 10 мл фільтрату	Одиниці протеолітичної активності, е	ПА при введенні 10 мл розчину при розбавленні
		1 : 100	1 : 50
1	2	3	4
0,30	0,0123	0,615	0,30
0,35	0,0167	0,835	0,418
0,40	0,0203	1,015	0,508
0,45	0,0243	1,215	0,608
0,50	0,0283	1,415	0,708
0,55	0,0320	1,600	0,800

Продовження табл.. 5.1.

1	2	3	4
0,60	0,0360	1,800	0,900
0,65	0,0393	1,965	0,982
0,70	0,0433	2,165	1,082
0,75	0,0473	2,365	1,182
0,80	0,0513	2,565	1,282
0,85	0,0550	2,750	1,375
0,90	0,0590	2,950	1,475
0,95	0,0627	3,135	1,573
1,00	0,0667	3,335	1,663
1,05	0,0700	3,500	1,750
1,10	0,0747	3,735	1,868
1,15	0,0787	3,935	1,968
1,20	0,0827	4,135	2,068
1,25	0,0867	4,335	2,168
1,30	0,0907	4,535	2,268
1,35	0,0950	4,750	2,375
1,40	0,0990	4,950	2,475
1,45	0,1033	5,165	2,582
1,50	0,1080	5,400	2,700
1,55	0,1123	5,616	2,808
1,60	0,1167	5,835	2,918
1,65	0,1213	6,065	3,032
1,70	0,1260	6,300	3,150
1,75	0,1307	6,535	3,266
1,80	0,1353	6,765	3,382
1,85	0,1400	7,000	3,500
1,90	0,1453	7,265	3,632
2,00	0,1500	7,500	3,750
2,05	0,1556	7,780	3,890
2,10	0,1603	8,015	4,008
2,15	0,1653	8,265	4,132
2,20	0,1707	8,035	4,268
2,25	0,1817	9,085	4,542
2,30	0,1873	9,365	4,632
2,35	0,1933	9,665	4,832
2,40	0,1993	9,965	4,982
2,45	0,2053	10,265	5,182
2,50	0,2113	10,565	5,232