Определение числа клеток кишечной палочки в колибактерине.

Цели занятия:

- определить число клеток кишечной палочки в колибактерине;

- проверить отсутствие посторонней микрофлоры в колибактерине.

Вопросы для самоконтроля:

1. Дайте понятие пробиотика.

2. Применение Колибактерина сухого.

3. С чем связана антагонистическая активность клеток кишечной палочки.

4. Методы определения антагонистической активности.

5. Методы определения биологической концентрации.

6. Окраска по Граму.

Вводная часть:

Для представителей вида Escherichia coli – грамотрицательных энтеробактерий, - названных в честь немецкого ученого Эшериха, впервые изолировавшего эти микроорганизмы из испражнений, нормальным местом обитания является кишечный тракт человека и животных. Содержание кишечных палочек в фекалиях здорового человека может достигать 10⁸ КОЕ/г. При динамическом обследовании удается обнаружить в пищеварительном тракте, как транзиторные штаммы кишечных палочек, так и культуры, выделяемые от одного и того же индивидуума на протяжении нескольких недель и даже месяцев. В связи с этим вопрос, являются ли бактерии рода Escherichia представителями автохтонной или аллохтонной микрофлоры человека, остается открытым. Представители вида Escherichia coli были первыми живыми кишечными бактериями, которые широко стали использоваться для лечения и профилактики заболеваний пищеварительного тракта. Первые упоминания об использовании кишечных палочек с лечебной целью относятся к 1889 году.

В 1959 году под руководством Л. Г. Перетца были изготовлены первые серии Колибактерина сухого путем лиофильного высушивания культуральной жидкости, содержащей биомассу кишечных палочек. В одной дозе этого препарата даже после 9 лет хранения сохранялось до 9*10⁹ КОЕ. Используемый для его производства штамм Escherichia coli М17, обладает выраженной антагонистической активностью в отношении многих патогенных и условно-патогенных энтеробактерий. В декабре 1960 года начался промышленный выпуск Колибактерина сухого первоначально в Нижнем Новгороде, затем в Москве и других городах СССР.

Колибактерин сухой назначают взрослым, а также детям начиная с 6-ти месячного возраста для лечения острых кишечных инфекций бактериальной и вирусной природы, для долечивания реконвалесцентов этих инфекций, больным колитами, энтероколитами на фоне дисбактериоза, возникающего вследствие длительного употребления или контакта с антимикробными препаратами различного происхождения. В последующие годы было показано, что антагонистическая активность Escherichia coli М17 преимущественно связана с присутствием в клетках внехромосомного фактора, детерминирующего синтез высокоактивной антимикробной субстанции белковой природы, носящей название колицин В. Заметим, что отсутствие достаточного контроля за генетическим статусом этого штамма привело к тому, что производственные штаммы этой кишечной палочки на некоторых предприятиях, производящих Колибактерин сухой, утратили Col В-плазмиду, что сопровождалось резким снижением клинической эффективности этого пробиотика. Проведенное изучение антагонистической активности Escherichia coli М17, его исходного штамма, а также 5 серий Сухого колибактерина в отношении 51 штамма патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов показало, что производственные культуры кишечных палочек по показателю антагонистической активности совпадают с авторским штаммом Escherichia coli М17П. Помимо шигелл и сальмонелл различных видов Escherichia coli М17 ингибировал рост клебсиелл, серраций, энтеробактерий, но слабо влиял на рост кандида и стафилококков.

Материалы и оборудование:

Колибактерин, пробирки со стерильным физиологическим раствором для получения разведений, стерильные чашки Петри с эритрит-агаром, микроскоп, предметные стекла.

Задание:

1. Определить число клеток кишечной палочки в колибактерине.

2. Проверить отсутствие посторонней микрофлоры в колибактерине. Провести микроскопирование исходной суспензии.

Ход работы:

В пенициллиновый флакон с сухим Колибактерином стерильно добавляем 5 мл физиологического раствора, и тщательно перемешиваем в течение 5-10 минут. Теоретическая концентрация клеток кишечной палочки во флаконе 50*10⁹. 0,1 мл суспензии переносим в пробирку с 4,9 мл физиологического раствора, таким образом, получаем миллиардную культуру. Затем делаем ряд разведений: 10⁸, 10⁷, 10⁶, 10⁵, 10⁴, 10³, 10², и высеваем по 0,1 мл на чашку Петри с эритрит-агаром 3,4,5,6,7-е разведения. Чашки ставим в термостат (37^оС) на 24 ч.

Для определения числа клеток кишечной палочки в колибактерине: подсчитывают клетки через 24 ч. Общее их число (х) определяют по формуле:

х = К*Р,

где К – среднее количество колоний; Р – степень разведения.

Приготовить фиксированный препарат из исходной суспензии, окрасить его по Грамму, микроскопировать при увеличении ×90.

Отчет по лабораторной работе должен содержать:

1. Название и цели работы.

2. Основные этапы работы.

3. Подсчет клеток кишечной палочки в колибактерине.

4. Проверка отсутствия посторонней микрофлоры в колибактерине.

5. Результаты микроскопирования исходной суспензии.

Лабораторная работа № 4.