Устройство световых микроскопов и техника микроскопирования. Особенности строения клеток прокариот и эукариот

Цели занятия:

• Изучить устройство светового микроскопа, освоить методику установки света, технику приготовления и микроскопирования временных препаратов.

• Познакомиться со строением клетки, научиться отличать прокариотические клетки от эукариотических.

• Научиться правильно оформлять отчет о лабораторной работе.

Вопросы и задания для самоподготовки

1. Основные свойства живого.

2. Уровни организации живой материи.

3. Основные положения современной клеточной теории.

4. Современное определение живого организма.

5. Надцарства (империи) и царства живых организмов.

6. Общая схема строения клеток прокариот и эукариот, их различия.

7. Органеллы прокариотической клетки.

8. Основные части микроскопа, их назначение и устройство.

9. Уметь показать на микроскопе механическую, оптическую и осветительную части и рассказать об их устройстве.

10. Что такое разрешающая способность микроскопа?

11. Порядок установки света на микроскопе.

12. Основные правила работы с микроскопом «Биолам Р-11» («Биолам Р-15»); в чем заключаются различия между этими микроскопами?.

13. Основные этапы приготовления временных микропрепаратов.

14. Правила произношения латинских терминов.

Оборудование и материалы:

1. Микроскопы (Биолам Р-11, Биолам Р-15).

2. Предметные и покровные стекла, чашки Петри, стаканчики с водой, глазные пипетки, пинцеты, ножницы, кусочки ваты, иммерсионное масло.

3. Постоянные микропрепараты: фиксированные окрашенные мазки культур сенной палочки и сарцины, крови лягушки.

4. Материалы для приготовления временных препаратов: 2-3 головки репчатого лука.

5. 0,01% раствор метиленовой сини, раствор иода.

Работа 1.1. Изучение устройства светового микроскопа

Световая микроскопия – один из основных методов изучения биологических объектов, поэтому владение техникой микроскопирования необходимо для всех последующих занятий по биологии и микробиологии, а также для практической деятельности микробиолога.

Рассмотрим конструкцию отечественных микроскопов Биолам Р-11 (с монокулярной насадкой) и Биолам Р-15 (с бинокулярной насадкой). Световой микроскоп состоит из трех основных частей: механической, осветительной, оптической. К м е х а н и ч е с к о й ч а с т и относятся: штатив, тубус, револьвер, макро- и микрометрические винты, предметный столик (рис.1).

Рисунок 1 – Устройство светового микроскопа Биолам Р-11

1 – основание штатива; 2 – коробка с механизмом точной фокусировки; 3 – микрометрический винт; 4 – тубусодержатель; 5 – макрометрический винт (кремальера); 6 – головка тубусодержателя; 7 – винт для крепления насадки; 8 – тубус; 9 – револьвер; 10 – винт крепления револьвера; 11 – кронштейн конденсора; 12 – рукоятка для перемещения конденсора; 13 – винт для закрепления конденсора в гильзе; 14 – откидная линза; 15 – зеркало; 16 – предметный столик; 17 – окуляр; 18 – объектив.

Штатив состоит из массивного основания (1) и изогнутого под углом тубусодержателя (4). Основание имеет снизу четыре опорные площадки, что обеспечивает устойчивое положение микроскопа на рабочем столе.

Тубусодержатель представляет собой колонку, подвижно соединенную с основанием через коробку механизма точной фокусировки (2). С одной стороны коробки укреплена направляющая, по которой перемещается кронштейн конденсора (11), с другой стороны имеется паз для перемещения направляющей с тубусодержателем.

В верхней части тубусодержателя имеется головка (6) для закрепления монокулярной (Биолам Р-11) или бинокулярной (Биолам Р-15) насадки и гнездо с винтовой нарезкой для револьвера (9). Тубус (8) представляет собой полую трубку, в верхнюю часть которой вставляется окуляр (17).

Револьвер (от лат. revolvo – вращаю) – это вращающийся диск с четырьмя гнездами для ввинчивания объективов (18).

Винт грубой настройки микроскопа (5) – макрометрический винт, или кремальера – расположен в нижней части тубусодержателя. С помощью этого винта тубус передвигается в вертикальном направлении вверх и вниз на большое расстояние. Макрометрический винт используется при слабом увеличении, когда объект изучается главным образом в одной плоскости.

Микрометрический винт в виде диска (3) находится внизу у самого основания микроскопа. Один оборот диска соответствует перемещению тубуса на 0,5 мм, а полный диапазон перемещения тубуса этим винтом от упора до упора составляет 2 мм. Микрометрический винт используется при сильном увеличении и позволяет рассматривать детали объекта, лежащие на разной глубине. Данным винтом следует пользоваться только тогда, когда при помощи кремальеры объект поставлен точно в фокус.

Предметный столик (16) крепится на механизме коробки точной фокусировки и представляет собой круглую или четырехугольную пластину с отверстием в центре, над которым помещают предметное стекло с изучаемым объектом. Во избежание смещения, предметное стекло фиксируют специальными клеммами, имеющимися на столике, или с помощью препаратодержателя. Предметные столики обычно подвижны: вращая вмонтированные слева и справа винтики, можно передвигать столик, а вместе с ним и предметное стекло в ту или иную сторону. В микроскопе Биолам Р-15 справа под предметным столиком находится винт механизма координатного перемещения, с помощью которого столик с препаратом можно передвигать в поперечном и продольном направлениях.

О с в е т и т е л ь н а я ч а с т ь микроскопа состоит из зеркала (15), осветителя, конденсора с ирисовой диафрагмой, откидной линзой (14) и съемного светофильтра.

Зеркало подвижно закреплено под предметным столиком, имеет две отражающие поверхности – плоскую и вогнутую. Пучок света попадает на зеркало, которое отражает свет к диафрагме, проходит через конденсор и отверстие столика и освещает исследуемый препарат. Зеркало лучше установить так, чтобы отраженные им лучи наилучшим образом освещали поле зрения микроскопа. Вогнутая поверхность сильнее концентрирует световые лучи, поэтому используется при слабом и рассеянном освещении. При работе со специальным осветителем приемлемо зеркало с плоской поверхностью.

Конденсор находится между зеркалом и предметным столиком, состоит из двух линз, закрепленных в общую оправу, вставлен в кронштейн (11), который крепится к коробке механизма точной фокусировки (2). Для перемещения конденсора служит специальная рукоятка (12), расположенная с правой стороны коробки. Меняя положение конденсора, можно изменять интенсивность освещения объекта: при опускании освещенность уменьшается, при поднимании – увеличивается.

Ирисовая диафрагма вмонтирована в нижнюю часть конденсора. Она представляет собой кольцо с подвижно укрепленными стальными пластинками, которые могут сдвигаться и раздвигаться с помощью особой ручки, находящейся с левой стороны; в центре остается отверстие для прохождения светового пучка. Диафрагма позволяет регулировать ширину светового потока; максимально суженная, она способствует наибольшей четкости изображения.

Дополнительная откидная линза (14), расположенная под оправой конденсора, используется при работе с объективами малого увеличения, а находящаяся над ней откидная рамка служит для установки синего светофильтра или матового стекла.

Для освещения может быть использован как естественный, так и искусственный свет. Для создания последнего применяются специальные осветители. Осветитель ОИ-32 помещается в посадочное гнездо в основании микроскопа вместо зеркала.

О п т и ч е с к а я ч а с т ь микроскопа представлена окулярами (17) и объективами (18).

Окуляр (от лат. oculus – глаз) помещается в верхней части тубуса и обращен к глазу. Окуляр представляет собой две линзы, заключенные в металлическую гильзу. По числу на верхней плоскости окуляра можно судить о кратности его увеличения (х7, х10, х15). Окуляр можно вынимать из тубуса и заменять по мере необходимости другим.

Объектив – это система линз, укрепленных в общей металлической оправе. Объективы ввинчиваются в гнезда револьвера и имеют различную кратность увеличения, которая обозначена числом на их боковой поверхности. Различают объектив малого увеличения (х9), объектив большого увеличения (х40) и иммерсионный объектив (х90), используемый для изучения наиболее мелких объектов.

Все объективы по способу применения делят на сухие и иммерсионные (от лат. immersio – погружаю или окунаю). У сухих объективов между фронтальной линзой и рассматриваемым препаратом находится воздух. Воздух и стекло имеют разные показатели преломления света (соответственно 1,0 и 1,52), в результате чего лучи света, переходя из одной среды в другую, преломляются, рассеиваются, происходит частичное искажение рассматриваемых объектов (рис.2). У иммерсионных объективов пространство между фронтальной линзой и препаратом заполнено, как правило, кедровым маслом или водой. Предметное стекло, стекло объектива и кедровое масло имеют почти одинаковый показатель преломления света (1,52 и 1,515), поэтому лучи, проходя из одной среды в другую, почти не преломляются, свет не рассеивается, рассматриваемые объекты не искажаются. Показатель преломления света, близкий к таковому стекла, имеют и другие вещества, которые используются в качестве иммерсионных составов: касторовое масло (1,48-1,49), гвоздичное масло (1,53), смесь касторового и гвоздичного масел (1,515).

Рисунок 2 – Ход лучей между конденсором и объективом микроскопа

Справа – сухой объектив, слева – иммерсионный. 1 – линза объектива; 2 – верхняя линза конденсора; 3 – предметное стекло; 4 – объект; 5 – покровное стекло; 6 – иммерсионное масло; 7 – воздух. АБ – луч света, проходящий через воздушную среду, отклоняется и не попадает в объектив; ВГ – луч света, проходящий через иммерсионное масло, попадает в объектив.

Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра. Эта величина, однако, не характеризует всех возможностей микроскопа. Увеличенное изображение может быть как

четким, так и нечетким. Отчетливость получаемого изображения определяется разрешающей способностью микроскопа. Под последней понимают минимальное расстояние между двумя точками, когда они еще не сливаются в одну, т.е. чем лучше разрешающая способность, тем меньший объект можно увидеть.

Разрешающая способность светового микроскопа определяется в основном дифракцией световых лучей и равна примерно половине длины волны используемого света. Освещая препарат светом с более короткой длиной волны (голубым или синим), можно увидеть более мелкие объекты; при этом разрешающая способность микроскопа близка к 0,2 мкм. С этой целью микроскоп укомплектован синим светофильтром.

Микроскоп Биолам Р-15 отличается от микроскопа Биолам Р-11 тем, что имеет бинокулярную насадку со встроенной оптической призмой, квадратный столик с препаратодержателем, механизм координатного перемещения препарата. За счет оптической призмы достигается дополнительное увеличение в 1,5 раза, поэтому при определении общего увеличения необходимо перемножить три числа – показатели увеличения объектива, окуляра и призмы.

ЗАДАНИЕ. Ознакомьтесь с устройством микроскопов «Биолам Р-11» и «Биолам Р-15». Найдите и назовите все их основные части.