2.2.Изучение инструкции к практическому занятию.

ПРИЛОЖЕНИЕ№ 3.

Инструкция по выполнению практической работы № 78 (43)по теме:

«Водно-минеральный обмен. Определение содержания фосфора в сыворотке крови».

Цели занятия:

1. Закрепить и углубить теоретические знания по теме: «Водно-минеральный обмен».

2. Изучить метод определения содержания фосфора в сыворотке крови.

Исходный уровень знаний и умений.

Учащийся должен знать:

1. Водный и электролитный баланс;

2. Патологию обмена фосфора;

3. Метод лабораторного исследования содержания фосфора в сыворотке крови;

4. Обмен кальция и фосфора, их концентрации в биологических жидкостях;

Учащийся должен уметь:

1. Организовать рабочее место для проведения исследования;

2. Практически выполнять определение фосфора в сыворотке крови колориметрическим методом;

3. Проводить дезинфекцию лабораторной посуды, биологического материала, рабочего места, перчаток, рук;

4. Заполнять бланк исследования;

5. Интерпретировать полученные результаты.

Структура занятия.

1. Теоретическая часть:

0. 1.1.Повторение теоретического материала по теме: «Водно-минеральный обмен».

1. 1.2.Рассказ преподавателя.

1. Указания к занятию. Методические рекомендации:

   0. 2.1.Внимательно изучите инструкцию.

   1. 2.2.Приготовьте всё необходимое оборудование, реактивы для проведения анализа.

   2. 2.3.Соблюдайте меры предосторожности при работе с биологическим материалом.

   3. 2.4. По окончании работы провести дезинфекцию использованного биологического материала, посуды.

3.Практическая часть.

А. 3.1. Лабораторная работа №1. Определение содержания фосфора в сыворотке крови.

Принцип: Фосфорная кислота взаимодействует в кислой среде с ванадатом и молибдатом аммония с образованием фосфорнованадиевомолибденовой кислоты желтого цвета. Концентрацию неорганического фосфора в сыворотке крови или моче определяют после осаждения белков.

Оборудование и реагенты.

1.Спектрофотометр, центрифуга;

2. Набор для определения содержания фосфора «Био-Ла-Тест».

3.Штатив с пробирками, пипетками.

4. Дез раствор 0,5% р-р полидеза.

5. Исследуемый образец: сыворотка крови.

А. Приготовление реагентов.

Опыт 1. Приготовление рабочих растворов.

Раствор. – 50 мл реактива2 (к-та ТХУ 1,47 ммоль/л)

Смешивают с 70 мл дистиллированной водой.

Раствор 2. – 1 долю реактива 3 (аммония ванадат р-р 2 ммоль/л)

Смешивают с 1 долей реактива 4. (аммония молибдат р-р 30 ммоль/л)

Раствор хранят в полиэтиленовой посуде.

Устойчивость: ежедневно приготавливают свежий раствор 2.

Раствор 4. – реактив 1 (стандартный р-р фосфор 5 ммоль/л) и раствор 1 смешивают в соотношении 1+1. раствор содержит 2,5 ммоль фосфора/л.

Устойчивость: несколько недель (с +15 до 25)⁰С.

Б. Проведение анализа.

Отмерить (мл)	Проба	Стандарт	Контроль
Сыворотка крови	0,2
Раствор 4		0,2
Дистиллир. Вода	0,6	0,6	0,8
Раствор 1	0,8	0,8	0,8

Перемешать и через 5 мин пробу центрифугируют в течении 19 мин при 3000 об/мин.

Надосадочная жидкость	0,8	0,8	0,8
Раствор 2	1,0	1,0	1,0

Перемешивают и через 20 мин измеряют оптическую плотность пробы (А₁) и калибратора (А₂).

λ= 380-410 нм; d= 1 см.

Расчёт:

Фосфор неорганический (ммоль/л) = 2,5 . А₁

А₂

Нормальные величины: 0,81-1,48 ммоль/л.

В. Проведение анализа с использованием набора реактивов для определения неорганического фосфора в биологических жидкостях по реакции с малахитовым зелёным «Агат-фосфор».

Принцип: Неорганический фосфор образует с молибденовой кислотой фосфорно-молибденовую кислоту, которая реагирует с малахитовым зелёным с образованием комплекса зелёного цвета, стабилизированного в растворе наличием детергента. Оптическая плотность комплекса при 630 нм пропорциональна концентрации неорганического фосфора в образце.

Подготовка реагентов для анализа.

Рабочий раствор детергента. Содержимое флакона «Детергент» разводят дистиллированной водой до общего объёма 100 мл. Раствор стабилен.

Проведение анализа.

Отмерить, мл	Проба	Контроль
Сыворотка крови	0,02
Дистиллир. вода		0,02
Раб. р-р детергента	2,0	2,0
Краситель	2,0	2,0

Тщательно перемешивают и через 10 мин. Определяют оптическую плотность пробы при длине волны 630 нм (600-650нм) против контроля.

d = 1 или 0,5 см.

Окраска устойчива в течение 2-х часов.

Расчет проводят по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика.

№ пробирки	Калибровочн. р-р фосфора, мл.	Дистиллир. вода	Концентрация фосфора ммоль/л
1	0,5	2,5	0,5
2	0,5	1,0	1,0
3	0,5	0,5	1,5
4	0,5	0	3,0

Полученные разведения обрабатывают так же, как и образец.

В каждую пробирку приливают 2 мл рабочего раствора детергента, затем 2 мл красителя, перемешивают и через 10 мин определяют оптическую плотность при λ=630 нм против контроля.

Примечание:

1. Во флаконе с красителем в процессе хранения допускается выпадение небольшого количества тёмного осадка, не влияющего на результаты анализа.

2. Используемая лабораторная посуда не должна содержать следов фосфора.

3. Рекомендуется кратковременное замачивание стеклянной посуды в хромпике.

Нормальные величины концентрации неорганического фосфора: в сыворотке и плазме крови – 0,8-1,6 ммоль/л.