Тема 2. Методи вивчення морфології вірусних часток.

Методи вивчення вірусних часток базуються на різних принципах та підходах при яких враховуються фізико-хімічні, біологічні властивості вірусів різних організмів, а також стан об’єкту, що використовується для виділення вірусу. До цих методів необхідно віднести: виділення вірусів шляхом отримання їх в ізоелектричній точці, отримання вірусів при осадженні сульфатом амонію; очистка на іонообмінний хроматографії; використання гель фільтрації, фракціювання вірусів та їх компонентів в градієнті сахарози, фракціювання електрофорезом в поліакриламідному гелі та ін.. Для приготування градієнтів концентрації застосовують крім сахарози також гліцерин, солі цезію та інші речовини. Фракціювання заклечається в тому, що різні компоненти суміші розділяються за швидкістю седиментації. Різні віруси утворюють зони, які інтенсивно розсіюють світло та легко проглядаються при підсвіченні, і їх можна фотографувати. Для такого дослідження вірусів та їх компонентів використовують різні типи роторів. Цей метод ефективний в тих випадках, коли у розчині є два віруси різної морфології.

Електрофорез в поліакриламідному гелі (ПАГ) базується на тому, що швидкість та напрямок руху компонентів, наприклад, білкової суміші в буферному розчині залежить від рН та його іонної сили. При цьому враховується те, що білки являють собою амфотерні електроліти і їх заряд змінюються у відповідності з рН середовища. В зв’язку з цим білкові молекули рухаються під час електрофорезу до анода або катода. Цей метод надзвичайно чутливий і його використовують при аналізі білків та нуклеїнових кислот вірусів.

Метод радіоізотопних попередників знайшов широке використання у вірусологічних дослідженнях шляхом підбору радіоактивних елементів. Що дає можливість простежити за технологією збірки, транспорту та локалізації вірусів в організмі. Існують відповідні прилади, які дають змогу розділяти та ідентифікувати випромінення різних ізотопів. В практиці сучасної вірусології часто використовують електрофорез та хроматографію з одночасним використанням ізотопної мітки. При дослідженні морфології вірусів, їх структури та локалізації в клітинах організму надійним методом являється просвічуюча електронна мікроскопія з різними модифікаціями підготовки об’єкту та його вивчення. Для дослідження вірусів препарат виготовляють безпосередньо із суспензій матеріалу, а також з очищених препаратів. Зразки наносять на плівку-підкладку з сіткою, а потім напилюють на вакуумних установках металами. Найбільш часто препарат контрастують фосфорно-вольфрамовою кислотою, ураніл ацетатом, та ін. Надійним методом вивчення локації вірусів в клітині, та структури клітинних компонентів в електронному мікроскопі є дослідження ультра тонких зрізів клітин ссавців, рослин, мікроорганізмів та ін. Ультра тонкі зрізи виготовляють на ультра мікротомах різних конструкцій та марок, препарати контрастують, а потім досліджують в електронному мікроскопі.

Значне поширення в дослідженні вірусів набули електронні методи за допомогою яких можна виявити приховану (латентну) вірусну інфекцію на ранніх періодах її розвитку. На сьогоднішній період вивчення біополімерів існують різні модифікації замірів їх спектрів. При цьому, система приладів дозволяє самореєструвати криві їх співвідношень, що дає змогу автоматично вимірювати концентрацію нуклеїнових кислот, визначати ступінь гвинтоутворення поліпептидів та білків.

2. По своїй будові віруси можна поділити на 4 типи, які відрізняються по характеру упаковки морфологічних субодиниць:

1) віруси з спіральною симетрією;

2) ізометричні віруси з кубічною симетрією;

3) вірус з бінарною симетрією, наприклад, фаги: у них головка має кубічний тип симетрії, а хвостик – спіральний;

4) більш складно організовані віруси, які мають другу оболонку.

Оболонка, в яку упакована геномна нуклеїнова кислота, називається капсидом. Найбільш просто організовані віруси представляють собою нуклеокапсиди: вони складаються тільки із нуклеїнової кислоти і білкової оболонки, яка збудована з ідентичних пептидних молекул. Існує всього два способи упаковки однакових білкових молекул в капсид, при яких він був би стабільним. Полімер буде стабільним, якщо він відповідає найменшому рівню вільної енергії. Процес утворення такого полімера споріднені з процесом кристалізації, він протікає по типу само зборки. Один із варіантів такої само зборки відбувається з використанням спіральної симетрії, другий – кубічної симетрії. При спіральній симетрії білкові субодиниці розташовуються по спіралі, а між ними, також по спіралі, укладена геномна нуклеїнова кислота. Краще всього цей тип організації вібріона вивчено у вірусу та бачної мозаїки. він представляє собою нуклеопротеїди, який має довжину 300 нм, діаметр 18 нм. Молекулярна вага вібріона 40апсид вібріона складається з 2130 білкових молекул, які по спіралі укладені навколо РНК. При спіральній симетрії білковий чохол краще захищає нуклеїнову кислоту, але при цьому потрібна більша кількість білка, ніж при кубічній симетрії

Більшість вірусів з замкненим чохлом має кубічну симетрію. В її основі полягають різні комбінації рівносторонніх трикутників, які утворюються із сполучення кулястих білкових субодиниць. Сполучаючись відповідним чином один з одним, вони можуть формувати замкнуту сферичну поверхню. Із різних сполучень рівносторонніх трикутників можуть з’являтися різні варіанти многогранників: тетраедри. октаедри і еконосаедри. Ікосаедр – сама ефективна і економічна симетрія для формування замкнутого чохла, так як у цьому випадку при його зборці використовуються білки мінімального розміру і забезпечується найбільший внутрішній об’єм вібріона.

Складніше збудовані віруси, які мають другу оболонку. спочатку вона отримала назву «пеплоса». Пізніше її стали називати суперкапсидом. він представляє собою звичайну біологічну мембрану, яка складається із двох ліпідів, які мають клітинне походження. Суперкапсидні вірусні білки, які утворюють шипи, виконують важливі для вірусу функції: вони розпізнають клітинні рецептори і зв’язуються з ними, сприяють розповсюдженню вірусу в організмі за рахунок злиття клітин. До складних вірусів належать ортоміксовіруси, параміксовіруси, коронавіруси. Віріон ретровірусів має ікосаедричний капсид, всередині якого знаходиться спіральний нуклеокапсид, а сам віріон вкритий ліпідною оболонкою, яка надає йому сферичну форму.

Найуспішніше метод електронної мікроскопії застосовують для виявлення вірусів, що не культивуються, а саме: ротавірусів, вірусу гепатиту А, кишкових аденовірусів, вірусу Норфолка, каліци-, астровірусів тощо. Метод імунної електронної мікроскопії є високочутливим; за його допомогою можна проводити серотипізування вірусів, вивчати антигенну будову вірусних часток.

Електронна мікроскопія – єдиний метод експрес-діагностики, який дає змогу візуально виявляти віруси в клінічному матеріалі незалежно від їхніх розмірів. За допомогою електронної мікроскопії можна виявити віруси у пробах, ідентифікувати їх за морфологією та дати відповідь протягом кількох годин. Це можливо, якщо вміст вірусних часток в 1 мл матеріалу становить 105—106 і більше.

Будова електронного мікроскопа. Для лабораторії діагностики вірусних інфекцій використовують електронні просвічуючі мікроскопи, наприклад, серійні мікроскопи "ПЕМ.-100" вітчизняного виробництва, "JЕМ 100СХ-2" японської фірми "Jeol", голландської фірми "Рhilips" та ін.

Електронний мікроскоп складається з вертикальної колони, в якій розміщені електронна гармата й система електромагнітних лінз, та пульта керування. Усередині колони створюється вакуум 1,3×103—1,3×104 кПа (10-4–10-5 мм рт. ст.).

Пучок електронів немовби просвічує об'єкт, взаємодіючи з атомами його речовин. При цьому електрони відхиляються від початкових траєкторій і потрапляють у магнітне поле лінзи об'єктива. Різні ділянки об'єкта, залежно від їх щільності, а також плівка-підкладка, на якій розміщений об'єкт, розсіюють електрони неоднаково. Чим щільніші ділянки, тим більша їхня розсіювальна здатність, отже, тим темнішим буде їхнє зображення на екрані. Лінза об'єктива, найважливіша частина електронного мікроскопа, формує первинне збільшене зображення об'єкта.

У колоні мікроскопа, нижче від лінзи об'єктива, розміщена проміжна лінза, призначена для одержання другого збільшення об‘єкта. І, нарешті, наступна після неї проекційна лінза створює остаточне збільшення зображення об‘єкта, видиме на флюоресціюючому екрані електронного мікроскопа.

Обробка клінічного матеріалу. Для клінічної діагностики антигенний матеріал не слід дуже очищати. Так. з метою виявлення вірусу грипу можна досліджувати й неочищену алантоїсну рідину. Суспензії калу, секрету носової частини глотки, біоптатів мозку необхідно освітлити.

Суспензію калу або біоптат мозку (10 %) готують на розчині Хенкса, гомогенізують струшуванням і центрифугують протягом 30 хв на швидкості 3000 об/хв. З надосадової рідини готують препарати й досліджують під мікроскопом.

Для дослідження методом імунної електронної мікроскопії вірусвмісний матеріал змішують із нерозведеною імунною специфічною сироваткою, а також з її розведеннями у 10 і 100 разів у співвідношенні 4 – 5:1. Після перемішування суміш витримують протягом 1 год при температурі 37 °С, потім протягом 16 – 18 год при 4 °С. Наступного дня суміш центрифугують протягом 30 хв на швидкості 10000 об/хв (для осадження імунних комплексів), а якщо досліджуються віруси невеликого розміру (типу парво-, пікорна-, паповавірусів) – протягом 30 хв (15000 об/хв). Осад ресуспендують у мінімальному об'ємі дистильованої води і готують препарати.

Приготування препаратів для електронної мікроскопії. Краплю суспензії вірусів або імунних комплексів наносять тонко відтягнутою пастерівською піпеткою на предметну сітку з опорною плівкою-підкладкою. Протягом 30—60 с вірусні частки адсорбуються на гідрофільній колодієвій плівці-підкладці. Зайву вологу видаляють фільтрувальним папером. Потім цю процедуру повторюють для концентрування вірусу на плівці-підкладці.

Негативне контрастування електронно-мікроскопічних препаратів здійснюють 2 % розчином ФВК безпосередньо на плівці-підкладці. Краплю ФВК наносять па предметну сітку з препаратом на кілька секунд (до 10с). Надлишок контрастуючої речовини знімають фільтрувальним папером.

Суть негативного контрастування полягає в тому, що контрастуюча речовина (ФВК або її солі) обволікає вірусні частки, проникає в їхні гідрофільні ділянки, замішуючи воду, і робить віріони електронно-щільними, чітко визначаючи при цьому їхню структуру. Контрастуюча речовина непроникна для електронного пучка, що легко проходить крізь органічний матеріал. Вірусні частки здаються світлими па темному тлі.

Дослідження в електронному мікроскопі проводять при інструментальному збільшенні у 30000—60000 разів. Переглядають не менше 5 – 10 пічок предметної сітки. Діагностичне важливим є тільки позитивний результат.