лекции биология

попавшего в клетку, синтезируется ДНК-копия РНК с помощью фермента – обратная транскриптаза. Сам процесс называется обратная транскрипция

(1970г.).

На основе этих данных в 1972-1973г.г. во многих лабораториях мира были синтезированы гены кролика, мыши, утки, крысы.

Но гены, синтезированные с помощью ревертаз (обратная транскриптаза) не имеют регуляторной части, а это препятствует функционированию искусственных генов в животных клетках, что ограничивает их использование. Кроме того, и-РНК в клетках очень немного, и она не стойкая.

В настоящее время рекомбинантные молекулы ДНК чаще всего получают путем гибридизации инвитро фрагментов ДНК вирусного и бактериального происхождения, и в меньшей степени эукариотического происхождения.

3. Создание рекомбинантных (гибридных) молекул ДНК.

Операция по получению рекомбинантных молекул состоит из нескольких этапов:

3.1. Выделение чужеродной ДНК для переноса в другую клетку.

Ферменты рестриктазы разрушают чужеродную ДНК, разрезая ее на отдельные участки. Причем каждая рестриктаза может действовать только на определенную последовательность нуклеотидов – сайты, т.е. участки опознования. При разрыве ДНК образуются фрагменты с однонитчатыми участками на концах (липкие концы, т.к. комплементарны друг другу).

3.2.Внедрение чужеродной ДНК в плазмиду; сшивание чужеродной ДНК с векторной ДНК.

Вектор способен переносить чужую ДНК внутрь бактерии, где она (эта ДНК) могла бы реплицироваться. Векторами могут быть плазмиды, бактериофаги, вирусы.

Плазмиды – это внехромосомные элементы, встречающиеся в клетке. Представляют собой замкнутые кольцевые молекулы двух цепочечной ДНК, способные реплицироваться независимо от геномной ДНК бактерии.

Чтобы включить участок ДНК в плазмиду, замкнутое кольцо плазмиды разрывают воздействием рестриктаз. Из кольцевой плазмида превращается в линейную структуру, в которой имеются липкие концы по отношению к фрагментам чужеродной ДНК.

Затем с помощью ферментов лигаз образуется плазмида, которая называется рекомбинантной, с включенным участком чужеродной ДНК.

3.3.Трансформация рекомбинантных плазмид в бактериальные

клетки.

Способы введения гибридной молекулы в бактерию или животную клетку зависят от вектора. Для бактерий – это трансформация, в случае использования фагов и вирусов – трансдукция.

Трансформация – это введение рекомбинантных плазмид в бактерии, обработанные специальным образом так, чтобы они стали проницаемыми для макромолекул. Однако плазмиды проникают лишь в часть обработанных

бактерий. Каждая из трансформированных бактерий размножается и образует колонию, такая бактерия называется клон.

3.4. клонирование и скрининг клонов.

Скрининг – это отбор среди клонов трансформированных бактерий тех, которые содержат плазмиды, несущие нужный ген. Для этого все бактериальные колонии накрывают специальным фильтром, на нем остаются отпечатки колонии. Затем фильтры помещают в раствор с радиоактивно меченым зондом – полинуклеотидом, комплементарным исходному гену. Радиоактивная метка позволяет найти среди множества клонов трансформированные бактерии, которые имеют плазмиды с нужным геном.

3.5. Молекулярная гибридизация.

С помощью клонирования можно получить копии любого фрагмента ДНК человека или другого организма.

Доказано, что бактериальные гены в составе гибридных молекул функционируют нормально. Гены растений, животных в плазмиды встраиваются хорошо, размножаются в неограниченном количестве, матричная и-РНК на них образуется, но эукариотический белок в бактериях не синтезируется. Так была открыта структура гена эукариот, состоящая из экзонов и интронов.

4. Достижения генной инженерии.

Создание искусственных генов, получение рекомбинантных ДНК, введение их в клетки может привести к возникновению новых организмов, опасных для человека. В связи с этим в 1974г. на Международной Конференции были выработаны правила, обязательные при работе с генетическим материалом.

Успехи генной инженерии должны быть использованы на благо человека: в борьбе с наследственными болезнями, для создания микроорганизмов – продуцентов белков. Врачи используют в генотерапии не только вирусы, приводящие к побочным явлениям, но и липосферы, состоящие из жировых капель, которые легко проникают сквозь клеточную оболочку и не дают осложнений.

При помощи разработанных сейчас «антисмысловых веществ» можно блокировать экспрессию генов, так как многие заболевания обусловлены неправильной экспрессией генов (злокачественные опухоли).

Антисмысловые соединения – это короткие одно цепочечные ДНК, которые взаимодействуют с и-РНК, несущими информацию от генов к рибосоме. В качестве антисмыслового гена используется как природная, так и синтетическая ДНК (синтетическая меньше разрушается ферментами).

При бесполом размножении новая особь образуется из соматических клеток: у растений – черенкованием, у животных – фрагментацией (у плоских червей, у кольчатых червей), полиэмбриония – появление монозиготных близнецов у человека.

При половом размножении участвуют, как правило, две особи. При гермафродитизме в организме образуются женские и мужские половые клетки, но происходит по возможности перекрестное оплодотворение.

Иногда в природе наблюдается партеногенетическое развитие (партеногенез) – развитие без оплодотворения (у насекомых, рыб, в эксперименте у млекопитающих и человека). Партеногенез может быть облигатным (обязательным) и факультативным (необязательным). Облигатный партеногенез отмечается у скальной кавказской ящерицы. За счет факультативного партеногенеза происходит регуляция численности полов: с оплодотворением развиваются самки, без оплодотворения – самцы.

При бесполом размножении быстро увеличивается количество особей, идентичных материнской.

При половом размножении при образовании гамет происходит комбинация генов, что обеспечивает появление в потомстве новых признаков.

Воснове бесполого размножения лежит митоз – непрямое деление ядра клетки.

Вклеточном цикле выделяют три периода интерфазы в подготовке клеток к делению:

Митоз.

Подготовка клеток(2n2c) к делению начинается в период интерфазы. Один из важнейших подготовительных процессов – синтез ДНК, то есть удвоение ее молекулы, происходящее в середине периода интерфазы (в s стадии). Таким образом, к митозу приступают клетки, содержащие удвоенное после синтеза количество ДНК (2n4c).

В митозе различают четыре фазы: профазу, метафазу, анафазу, телофазу.

Во время профазы в ядре появляются тонкие нити – хромосомы, которые спирализуются, укорачиваются и утолщаются. К концу профазы все хромосомы хорошо видны в световой микроскоп.

Во время профазы центриоли, а их две в каждой клетки, расходятся к противоположным полюсам клетки и между ними образуется веретено деления. В конце профазы ядерная оболочка растворяется и хромосомы свободно располагаются в цитоплазме, ядрышки исчезают.

За профазой следует метафаза митоза. Во время метафазы завершается образование веретена деления, и хромосомы располагаются в экваториальной плоскости веретена. Каждая хромосома прикрепляется своим центральным участком (центромерой) к одной из нитей веретена. У каждой хромосомы происходит отделение, обособление хроматид друг от друга.

Когда все хромосомы оказываются прикреплёнными к нитям веретена, хроматиды каждой хромосомы начинают расходиться к полюсам клетки: к одному полюсу отходит одна хроматида, к противоположному – другая.

Начало расхождения хроматид к полюсам клетки означает, что наступила следующая фаза митоза – анафаза. Во время анафазы хроматиды (дочерние хромосомы) расходятся к полюсам клетки (4n4c). Движение хромосом осуществляется благодаря нитям веретена, которые сокращаются и растягивают дочерние хромосомы от экватора к полюсам клетки. Последняя фаза митоза – телофаза. Во время телофазы приблизившиеся к полюсам клетки хромосомы начинают раскручиваться и снова приобретают форму длинных нитей, переплетающихся друг с другом. В дочерних ядрах вновь образуется ядерная оболочка, формируется ядрышко и полностью восстанавливается характерное для интерфазы строение ядра. На протяжении телофазы происходит и деление цитоплазмы, в результате которого две дочерние клетки отделяются друг от друга. Эти клетки по строению полностью сходны с материнской(2n2c).

Биологический смысл митоза – генетический материал передаётся из клетки в клетку в неизмененном виде.

Амитоз – прямое деление ядра клетки. Таким способом размножаются больные клетки путём перетяжки без образования веретена деления; при этом генетический материал в дочерние клетки передается приблизительно поровну.

Мейоз.

Мейоз – особый способ деления клеток, который происходит во время созревания гамет.

Гаметогенез основан на мейозе, который представляет собой процесс редукционного деления ядер клеток (2n2c), сопровождающийся понижением числа хромосом на ядро. Мейоз происходит в специализированных клетках репродуктивных органов живых существ, размножающихся половым путём.

Сперматогенез – процесс образования зрелых мужских половых клеток. Мейоз в сперматогенезе протекает в несколько стадий (фаз). Между делениями имеются две интерфазы.

Интерфаза1 характеризуется тем, что в ней происходит репликация хромосом (удвоение ДНК).

Первое мейотическое деление начинается в первичном сперматоците (2n4c) и характеризуется длинной профазой. В профазе1 различают пять главных стадий – лептонему, зигонему, пахинему, диплонему и диакинез.

1.Лептонема – стадия тонких нитей. ДНК, а значит и хроматиды деспирализованы.

2.Зигонема – стадия сливающихся нитей. Гомологичные хромосомы расположены парами.

3.Пахинема – стадия толстых нитей. Хромосомы образуют бивалент или тетраду. (Каждая хромосома состоит из двух хроматид, объединенных центромерой). Происходит конъюгация хромосом, во время которой гомологичные хромосомы обмениваются участками (явление перекреста или кроссинговера).

На стадии зигонемы и пахинемы наблюдается синаптонемальный комплекс

(СК). Эта субмикроскопическая структура выглядит как набор плоских параллельных нитей, расположенных по всей длине бивалента в плоскости

бивалентов в веретене деления и строгую редукцию числа хромосом. СК необходим для нормального удержания гомологов в биваленте так долго, как это

необходимо для осуществления кроссинговера. СК является как бы жесткой рамкой, внутри которой может беспрепятственно происходить и, скорее всего даже облегчается точный и равный кроссинговер. Исчезновение СК в диплонеме оправдано тем, что его функция к этому времени выполнена.

4.Диплонема – между диадами возникают силы отталкивания.

5.Диакинез – отталкивание диад завершается, оболочка ядер растворяется, происходит ориентация диад на экваторе.

Начинается метафаза1. Формируется ахроматиновое веретено. В анафазе1 гомологичные хромосомы (диады) отходят к противоположным полюсам клетки, при этом хромосомы из разных аллельных пар комбинируются равновероятно, а число хромосом становится гаплоидным (1n). Затем наступает телофаза1, в течение которой хромосомы достигают полюсов, чем заканчивается первое мейотическое деление. Интерфаза2 между первым и вторым делениями очень короткая, удвоение ДНК не происходит. После первого мейотического деления клетки называют сперматоцитами второго порядка (1n2c).

Второе эквационное деление протекает как митоз: центромера делится, и хроматиды уходят к противоположным полюсам клетки, т. е. в разные гаметы. В результате чего каждый сперматоцит второго порядка дает две сперматиды (1n1c), из которых дифференцируются затем сперматозоиды (1n1c). Как и во вторичном сперматоците, число хромосом в сперматиде является гаплоидным (1n).

Овогенез.

Отличия овогенеза от сперматогенеза. В овогенезе:

1.Короткий период размножения. Заканчивается в эмбриогенезе.

2.Нет периода формирования.

3.Образуется одна яйцеклетка, где концентрируется весь запас питательных веществ, и три редукционных тельца.

Генетический смысл мейоза.

1.Уменьшение числа хромосом в половых клетках приводит к сохранению постоянства числа хромосом вида и предопределяет видовую специфичность потомства.

2.Поддерживаются цитологические основы чистоты гамет. Гаметы содержат по одному гомологу из каждой пары хромосом.

3.Определяется разнообразие гамет за счет равновероятных комбинаций хромосом из разных аллельных пар во время анафазы первого деления мейоза и за счет кроссинговера.

Правило хромосом.

1.Постоянство числа. Каждый вид организмов имеет определенное и постоянное число хромосом.

2.Парность хромосом. Хромосомы в соматических клетках находятся парами.

3.Специфичность. Хромосомы разных пар имеют отличия (по размеру, набору генов, расположению центромеры и т. д.)

4.Непрерывность хромосом. Способность хромосом передаваться из клетки в клетку в неизмененном виде за счет репликации ДНК.

А├┤а – гетерозиготная особь;

F2 – потомство гибридов F1.

3-ий закон Менделя. (Закон независимого наследования признаков).

Расщепление по каждой паре признаков идет независимо от других пар признаков.

G:

F1: (1/4АА + 1/2Аа + 1/4аа) × (1/4ВВ+ 1/2Вв + 1/4вв)= =1/16ААВВ + 1/8ААВв + 1/16ААвв + 1/8АаВВ+ 1/4АаВв + + 1/8Аавв + 1/16ааВВ + 1/8ааВв + 1/16аавв

9 разных генотипов

(3/4А + 1/4а)×(3/4 В + 1/4в)= 9/16АВ + 3/16Ав + 3/16аВ + 1/16ав

по фенотипу

Условия Менделирования признаков.

(независимого наследования генов).

Согласно закону Менделя во 2ом поколении наблюдается расщепление по фенотипу 3:1, но эти соотношения выявляется только при следующих условиях:

1.В мейозе должно происходить равновероятное образование гамет обоих полов, то есть количество гамет с аллелем А равно количеству гамет с аллелем а.

2.Встреча гамет и сочетание их при оплодотворении происходит равновероятно.

3.Доминантный ген полностью доминирует над рецессивным.

4.Один ген определяет развитие одного признака.

5.Особи, развивающиеся из всех типов зигот, обладают равной выживаемостью, поэтому соотношение близкое к 3:1, получается только при большом числе наблюдений.

Хромосомная теория наследственности.

На втором этапе развития генетики (1911–1925 гг.) Томас Морган и его ученики подвели цитологическую базу под законы наследственности и сформулировали основные положения хромосомной теории наследственности. Эта теория была основана на результатах гибридологического анализа, созданного Менделем, и использована Морганом в исследованиях на плодовой мухе дрозофиле.

Дрозофила – удобный генетический объект:

∙Быстро размножается, то есть происходит быстрая смена поколений;

∙Имеет четкие мутантные формы (цвет глаз, форма крыльев, цвет тела);

∙Легко культивируется;

∙Четыре пары хромосом;

∙Самка и самец отличаются по внешнему виду, что позволило открыть сцепленное с полом наследование.

Положения хромосомной теории наследственности.

1.Основная масса наследственного материала находится в хромосомах (в настоящее время известно, что часть ДНК находится в митохондриях, пластидах у растений, плазмидах у бактерий).

2.Каждая хромосома содержит свой комплекс генов, который наследуется совместно. Эти гены образуют группу сцепления. Число групп сцепления у каждого вида равно числу хромосом в гаплоидном наборе.

3.Каждый ген занимает в хромосоме определённый локус (участок). Гены располагаются в хромосоме в линейной последовательности.

4.Сцепление между генами в хромосоме может нарушаться в результате кроссинговера.

Кроссинговер – перекрест гомологичных хромосом и обмен генетическим

материалом.

Условия выявления кроссинговера.

1.Кроссинговер происходит на стадии пахинемы, в профазе1 мейоза, когда в результате конъюгации гомологичные хромосомы образуют биваленты.

2.Кроссинговер обнаруживается в потомстве только в том случае, если особь гетерозиготна. У гомозиготы перекрест возможен, но он не дает новых комбинаций генов.

3.Кроссинговер выявляется между несестринскими внутренними хроматидами, поэтому величина кроссинговера не может быть больше 50%.

4.Для выявления кроссинговера проводится анализирующее скрещивание (с рецессивной гомозиготой).

Величина перекреста зависит от:

∙Расстояния между генами (чем оно больше, тем больше величина перекреста и наоборот).

∙Условий (например, от изменения температуры воздуха: процент кроссинговера повышается при t > 30°C или t < 13°C; у насекомых отряда Двукрылые кроссинговер выявляется только у самок).

∙Величина перекреста может быть меньше ожидаемой в результате интерференции. Это возможно при множественном кроссинговере, то есть когда он происходит сразу в нескольких местах, поэтому, возникнув в одном месте, он мешает перекресту на другом.

Величина интерференции I зависит от коэффициента совпадения: С – коинциденция.

I = 1 – C

C = (фактическое число двойных кроссоверов)/ (теоретическое число двойных кроссоверов)

Если коинциденции нет, то С=1. Если кроссинговер препятствует осуществлению второго кроссинговера, то интерференция называется положительной, она стремится к 1, а С стремится к нулю. Если первый кроссинговер повышает вероятность второго, что очень редко, то С > 1.

При неравном кроссинговере возникают хромосомные мутации – делеции и дупликации.

Делеция – потеря участка хромосомы, несущего один или несколько генов. Дупликация – добавление (удлинение) какого-либо участка хромосомы, несущего

один или несколько генов.

Взаимодействие генов.

1.Наследование, сцепленное с полом.

2.Плейотропное действие гена.

3.Взаимодействие аллельных генов: Доминирование.

Промежуточное наследование. Сверхдоминирование. Кодоминирование. Межаллельная комплементация. Аллельное исключение.

4.Взаимодействие неаллельных генов. Комплементарное взаимодействие. Эпистаз (подавление).

Полимерия.

Модифицирующее действие гена. Эффект положения.

5.Пенетрантность и экспрессивность гена.

1. Наследование, сцепленное с полом.

Аутосомы, составляющие одну гомологичную пару, совершенно подобны друг другу. Половые хромосомы или гетерохромосомы могут сильно различаться между собой как по морфологии, так и заключенной в них генетической информации. У человека 23 пары хромосом: 22 пары – аутосомы и одна пара – половые хромосомы.

Сочетание половых хромосом в зиготе определяет пол будущего организма. Большую из хромосом этой пары называют Х-хромосомой, меньшую – Y-хромосомой. У некоторых животных Y-хромосома отсутствует, у всех млекопитающих ( в том числе у человека), у дрозофилы и многих других животных женские особи в соматических клетках имеют две Х-хромосомы, а мужские – Х- и Y-хромосому. У этих организмов все яйцеклетки одинаковые, они содержат Х- хромосомы. Сперматозоиды у них образуются двух типов. Одни содержат Х- хромосому, другие – Y- хромосому. Поэтому при оплодотворении возможны две комбинации:

1.Яйцеклетка, содержащая Х-хромосому оплодотворяется сперматозоидом с Х- хромосомой. В зиготе встречаются две Х-хромосомы, из этой зиготы развивается женская особь.

2.Яйцеклетка, содержащая Х-хромосому оплодотворяется сперматозоидом, несущим Y-хромосому. В зиготе сочетается Х- и Y-хромосомы. Из этой зиготы развивается мужской организм. Таким образом, сочетание половых хромосом в зиготе, а следовательно и развитие пола ( у человека, млекопитающих, дрозофилы) зависит от того, каким сперматозоидом будет оплодотворено яйцо.

Сперматозоидов с Х- и Y-хромосомой примерно одинаковое число, поэтому особей обоего пола рождается примерно поровну.

Уптиц, бабочек, некоторых пресмыкающихся женские особи имеют разные половые хромосомы, а мужские – одинаковые. Так, у петуха в соматических клетках содержатся две Х-хромосомы и все сперматозоиды его одинаковые. Курицы наряду

сХ-хромосомой несут Y-хромосому. Поэтому яйца бывают двух типов: у прямокрылых (класс насекомые) Y-хромосома отсутствует. В этом случае гаметы самца несут либо Х-хромосомы, либо ничего не несут.