3. Принцип метода гель-фильтрации, практическое применение метода.

Принцип: компоненты, находящиеся в растворенном состоянии (подвижная фаза, элюент) – буферно-солевой раствор, пропускают через носитель (неподвижную фазу) – гидрофильные гранулы геля в колонке. Поры гранул имеют различный размер, т.е. недоступны для молекул, имеющих размер больше, чем размер пор. Чем крупнее молекулы, тем быстрее они будут выходить из колонки (меньше задерживаться в порах гранул), т.е. будут выходить в первых фракциях (элюат). Разделение белков в зависимости от размера.

Носители:

• сефадекс – матрица на основе ПС декстрана. Гидрофилен – в водных растворах сильно набухает; нити декстрана сшиты м/д собой – размер пор регулируется # поперечных сшивок.

• сефароза – матрица на основе геля агарозы (гетерополисахарида с мономером - агаробиозой). Гидрофильна, имеет множество водородных связей – образует жесткий каркас из пучков нитей агарозы с пустотами внутри.

Применение:

• метод для оценки молекулярной массы молекул

• очистка веществ, фракционирование по размеру

• разделение мономеров, димеров и агрегатов более высокого порядка

• анализ высокомолекулярных примесей

• определение молекулярной массы аналита

• обессоливание растворов и смена буфера

4. Принцип метода количественного определения мочевой кислоты в организме человека, оценка результатов

Принцип: метод основан на осаждении мочевой к-ты в виде соли – мочекислого аммония, которую после растворения горячей водой титруют перманганатом калия. В колбу вносят мочу, 25% р-р аммиака и сернокислый аммоний, перемешивают, через 15 минут фильтруют ч/з бумажный фильтр. Промывают колбу сернокислым аммонием, сливая промывную жидкость на фильтр. Фильтр переносят в чистую колбу, добавляют горячую воду и раствор серной кислоты. Далее титруют раствором перманганата калия до появления слабо розового окрашивания.

Оценка: используется для оценки состояния пуринового обмена. В норме выведение мочевой кислоты из организма при беспуриновой диете = 1.6 – 3.5 ммоль/стуки. Гипоурикурия наблюдается при подагре или почечной недостаточности. Гиперурикурия – при усиленном распаде нуклеопротеинов в тканях.

5. Принцип метода определения содержания билирубина в сыворотке крови, оценка полученных результатов

Принцип:

Оценка:

6. Принцип метода определения кальция в крови, оценка полученных результатов.

Принцип: Комплексонометрический метод. Комплексоны – опред. орг. соедин. (ЭДТА = этилендиаминтетраацетат) – способны избирательно связываться с ионами кальция в сыворотке. Ионы кальция, связанные с индикатором, титруются ЭДТА. При полном связвании кальция с комплексоном происходит интенсификация окраски индикатора (от фиолетовой до темно-синей).

Оценка: Норма кальция в крови = 2.2-2.8 ммоль/л. Гиперкальциемия бывает физиологической (у новорожденных), алиментарной и патологической (гиперфункция паращитовидных желез, гипервитаминоз D). Гипокальциемия – при рахите (гиповитаминоз D), при гипофункции паращитовидных желез.

7. Принцип метода определения фосфата в сыворотке крови, оценка полученных результатов.

Принцип: неорг. фосфат + молибденовый реактив + в присут. аскорб. к-ты = молибденовая синь, интенсивность окраски пропорциональна содержанию фосфата (фотоэлектроколориметр).

Оценка: N=1-1.6 ммоль/л. Гиперфосфатемия при: почечн. недостаточности, гипопаратиреозе, гипервитаминозе D. Гипофосфатемия при: недостатке Ф в пище, нарушении всасывания Ф в кишечнике. Са/Р = 1.9-2

8. Принцип метода определения активности трансаминаз, оценка полученных результатов.

Принцип:

АСТ – катализирует р. трансаминирования м\д аспартатом и альфа-КГ  ЩУК + глутамат.

АЛТ – катализирет р. трансаминирования м\д аланином и альфа-КГ  ПВК + глутамат.

ПВК и ЩУК в щелочной среде с 2.4-динитрофенилгидразином дают окраску. Интенсивность пропорциональна концентрации ПВК и ЩУК (фотоэлектроколориметр).

Оценка: по калибр. графику. N АСТ = 0.1-0.45 ммоль/час*л; N АЛТ = 0.1-1 ммоль/час*л. При повышении – разрушение клеток: АСТ – повреждения миокарда, АЛТ – поражения печени.

9. Принцип метода определения концентрации гемоглобина в крови, оценка полученных результатов.

Принцип: В реакции с ацетонциангидриновым реактивом гемоглобин + красная кровяная соль  metHb + ацетонциангидрин  гемоглобинцианид. Интенсивность окраски соответствует кол-ву Hb (фотоколориметр).

Оценка: по калибр. графику. N = 120(130) - 130(145) г/л. Повышение при полицитемии и гемолизе, повышенной физ. нагрузке и подъеме на высоту. Снижение при анемиях разной этиологии.

10. Принцип метода определения концентрации глюкозы в крови, оценка полученных результатов.

Принцип: р. окисления глюкозы гокюзооксидазой : глю + О₂  глюколактон + Н₂О₂

фермент-пероксидаза: Н₂О₂ + хромоген*Н₂  2Н₂О + хромоген (в окисленом виде - красный).

Интенсивность окраски соответствует концентрации глюкозы (фотоколориметр). Вычисления по формуле.

Оценка: N=3.5-5.5 ммоль/л. Гипогликемия при голодании, избыточном выделении из организма глюкозы или инсулина в кровь. Гипергликемия физиологическая или патологическая (СД).

11. Принцип фотометрии. Устройство фотоэлектроколориметра.

ФЭК служит для определения концентраций окрашенных растворов по поглощению света этими растворами.

Луч света от источника проходит через светофильтр. Полученный монохроматический свет проходит через кювету с раствором. Кюветы – сосуды, в которые помещают анализируемый раствор и раствор сравнения. Они представляют собой прямоугольные сосуды с определённым расстоянием между стенками. Для аналитических измерений важен не общий объём раствора, помещённого в кювету, а толщина слоя раствора, которая определяется расстоянием между передней и задней стенками. Кюветы изготавливают из стекла, пропускающего все лучи видимого спектра. Для анализа в ультрафиолетовой области спектра применяют кюветы из кварца, пропускающего не только видимые, но и ультрафиолетовые лучи.

Прошедший через раствор свет, попадает на фотоприёмник – фотодиод, который преобразует энергию световой волны в электрический ток. Сигнал усиливается усилителем - и поступает на измерительный элемент (гальванометр), где находятся две шкалы. На нижней шкале нанесены значения оптической плотности раствора, а на верхней – коэффициента пропускания в процентах.

Принцип измерения коэффициента пропускания и оптической плотности состоит в том, что на фотоприёмник направляют поочерёдно световые потоки – полный и прошедший через анализируемый раствор. Вначале в световой поток помещают кювету с раствором сравнения (растворитель или дистиллированная вода). Изменением чувствительности фотоэлектроколориметра добиваются, чтобы отсчёт по шкале коэффициентов пропускания был равен 100 делениям (или нулю по шкале оптической плотности). Таким образом, полный световой поток условно принимается за 100%. Затем в световой поток помещают кювету с исследуемым раствором. Вследствие поглощения света раствором световой поток ослабляется, и стрелка гальванометра отклоняется от нуля. По показаниям стрелки на шкале определяют значение оптической плотности или коэффициента пропускания исследуемого раствора.

12. Качественные реакции на моносахариды, дисахариды и полисахариды. Принципы методов этих реакций.

13. Цветные реакции на аминокислоты. Принципы методов. Практическое применение.

14. Методы определения белковых фракций крови. Оценка результатов.

Принцип: в 7 пробирок с разной концентрацией буф. р-ра переносят равное кол-во смеси Б фракций крови. В зависимости от концентрации буф. р-ра Б крови осаждаются по-разному. По степени мутности р-ров (ФЭК) судят о концентрации Б фракций.

Оценка: установление диспротеинемии

• общий Б = 100%

• Альбумины = 56.6.-66.8

• альфа 1-глоб. = 3-5.5

• альфа 2-глоб.=6.9-10.5

• бета-глоб. =7.3-12.5

• гамма-глоб.=12.8-19

15. Проба с сахарной нагрузкой, критерии ее оценки.

Принцип: после приема углеводов концентрация глюкозы в крови повышается (алимент. гиперглик.). Через равные промежутки времени (каждые 15-30 минут) определяют кол-во моль глюкозы в крови. По данным строят сахарную кривую.

Оценка: позволяет выявить скрытую форму СД. В N=3.5-5.5 ммоль/л. После приема 100г глюкозы C=8-10 ммоль/л. Через 2 часа должна вернуться к N. При скрытой форме СД макс. конценстрация превышает 8-10 ммоль/л, а через 2 часа все еще превышает норму.

Определяют 2 доп. величины:

• коэфф. Бодуэна – отношение величины пика глю к концентрации натощак (N=1.3-1.5)

• коэфф. Рафаэльского – отношение концентрации ч/з 2 часа к концентрации натощак (N=0.9-1.1)

16. Принцип метода определения активности панкреатической липазы. Оценка результатов анализа.

Принцип: Панкр. липаза активирует р. гидролиза жира до глицерина и ЖК. В стаканчик с контролем добавляют индикатор и титруют до светло-розовой окраски. Стаканчик опытной пробой предварительно ставят в термостат (37 град.), а затем то же самое. Титрованием щелочью определяют кол-во образовавшихся ЖК за 1 час. Активность рассчитывают по формуле.

Оценка: N=0.4-30 ммоль/час*л. Увеличение активности липазы говорит о поражении кл. поджелуд. железы и большом содержании фермента в крови.

17. Принцип метода определения базальной и стимулированной кислотности желудочного сока. Оценка результатов анализа.

Принцип: Содержание НСl в желудочном соке определяют титрованием пробы щелочью с индикатором пара-ди-метил-амидо-азо-бензолом. ПДМААБ проявляет окраску уже в слабокислой среде, поэтому определяет кол-во сильной соляной кислоты. При добавлении индикатора: есть НСl – красно-оранжевая окраска; нет НСl – желтая окраска. Оранжевую окраску титруют щелочью до желтой, расчет ведут по титру NaOH.

Базальная секреция показывает, сколько молей НСl выделяется в слизистой желудка за час натощак.

Стимулированная секреция показывает, сколько молей НСl выделяется слизистой после введения стимулятора секреции (гистамин, пентагастрин) за 1 час.

Оценка: N базальн. = 1-4 ммоль/ч; N стимул. = 16-22 ммоль/ч.

Гипоацидный гастрит – базальн. в N, стимулир. понижена

Гиперацидный гастрит – базальн. в N, стимулир. повышена

18. Принцип метода определения концентрации белка в моче. Оценка результатов анализа.

Принцип: сульфосалициловая к-та вызывает денатурацию Б в моче и наблюдается помутнение раствора. Степень помутнения пропорциональна концентр. Б (ФЭК).

Оценка: по калибр. графику. находят кол-во Б в моче, а затем эту цифру умножат на кол-во литров мочи за сутки.

N суточная потеря Б с мочой < 100 мг/л. Протеинурия – нарушение функции почек.

19. Качественные реакции на белок в моче. Принципы методов.

20. Принцип метода определения концентрации b-липопротеинов крови. Оценка результатов анализа.

Принцип: Антикоагулянты – хлорид кальция и гепарин – снижают растворимость Б сыворотки крови, из-за чего возникает осаждение бета-ЛП и появляется помутнение р-ра. Интенсивность ~ концентрации. После добавления каждого антикоагулянта помутнение измеряют на ФЭК. Разность экстинкций * 100 – содержание ЛП.

Оценка: N натощак = 35-55 у.е. Повышение – атеросклероз.

21. Принцип метода определения концентрации витамина «С» в биологических жидкостях. Оценка результатов анализа.

Принцип: аскорб. к-та в кислой среде восстанавливает йод, а сама окисляется, что можно увидеть при титровании к-ты йодом в присутствии крахмала. Вывдение аск. к-ты рассчитывается при умножении титра йода на суточный диурез.

Оценка: N=280-560 ммоль/сут. При цинге уровень витамина С в моче снижается.

22. Принципиальные основы определения активности фермента в биологической жидкости или ткани. Привести пример.

Для определения активности фермента требуется:

• чистый фермент/ источник фермента (сыворотка, слюна, моча)

• субстрат

• оптимальные условия

• инкубировать определенное время

• остановка ферментативной реакции (денатурация Ф, охлаждение, ингибиторы)

• определение кол-ва продукта/субстрата (ФЭК, титрование, качеств. реакции)

• расчет активности Ф

Влияние температуры: 4 пробирки с равным кол-вом слюны и амилазы помещают в разные условия:

1. в лед

2. комнатная температура

3. термостат

4. кипящая водяная баня

Оценка – по интенсивности окраски с йодом (есть крахмал – синяя, нет крахмала - желтая).

Влияние рН: В 3 пробирки с разной рН добавляют крахмал и ставят в термостат. После инкубации охлаждают + пробирку с щелочной средой нейтрализуют, т.к. крахмал не дает окраску с йодом в щел. среде. Находят рН оптимум по интенсивности синей окраски.

23. Принципиальные основы титрометрии (титрования). Применение метода для биохимического анализа. Привести пример.

Титриметрический метод анализа - метод количественного анализа, основанный на измерении объема раствора с точно известной концентрацией реактива, требующегося для завершения реакции с данным количеством определяемого вещества.

Титр - точная концентрация раствора реактива, которая выражается числом граммов растворенного вещества, содержащегося в 1 мл раствора.

Титрованный раствор - раствор реактива точно известной концентрации. Концентрацию стандартного раствора реактива обычно выражают в граммах на миллилитр (г/мл) или в единицах нормальности.

Метод заключается в том, что к раствору определяемого вещества постепенно прибавляют раствор реактива известной концентрации. Добавление реактива продолжают до тех пор, пока его количество не станет эквивалентным количеству реагирующего с ним определяемого вещества. Основоположником титриметрического анализа является французский ученый Ж. Л. Гей-Люссак.

Реакции, применяемые в анализе: нейтрализации, осаждения, комплексообразования, окисления—восстановления.

24. Определение кетоновых тел в моче. Практическое применение метода.

Принцип: Кетоновые тела (ацетон, ацетоацетат, бета-гидроксибутират) взаимодействуют с нитропруссидом натрия и окрашивают раствор в красный цвет. Интенсивность ~ концентр. кетон. тел. Полученную окраску сравнивают с предварительно приготовленной шкалой стандартных растворов.

Оценка: N=20-50 мг/л. Кетонурия – при углеводном голодании и СД.

25. Построение калибровочных графиков для фотометрии. Привести примеры.

1. Построение калибровочной кривой начинается с приготовления ряда разведений стандартного раствора исследуемого вещества. Стандартный раствор содержит вещество в известной концентрации. Разведения стандартного раствора должны охватывать диапазон физиологических концентраций и выходить за пределы их минимальных и максимальных величин. Ряд калибровочных разведений получают путем разбавления основного стандартного раствора.

2. Затем ведут обработку стандартных растворов аналогично опытным пробам. Измеряют оптическую плотность калибровочных растворов и опытной пробы на одном и том же приборе. Измерения оптической плотности начинают со стандартного раствора наименьшей концентрации.

3. Усредненные (соответствующие отдельным концентрациям) значения оптической плотности - D (экстинкции - Е) наносят на миллиметровую (калибровочную) бумагу. На оси абсцисс (горизонтальной) с соблюдением одинаковых интервалов в равномерно возрастающей концентрации откладывают показатели содержания вещества в стандартном растворе; на оси ординат (вертикальной) - соответствующие им величины оптической плотности.

Зависимость между концентрацией вещества в стандартных (калибровочных) пробах и оптической плотностью, соответствующей этим пробам, отражается линией, построенной по точкам. Строить калибровочный график следует не менее чем по пяти точкам.

Калибровочная кривая прокладывается таким образом, чтобы по возможности большее число точек (например, 3 из 5) лежало на линии, а остальные располагались близ нее, равномерно отклоняясь в ту и другую стороны. Отдельные точки, значительно смещающиеся от калибровочной кривой и обычно являющиеся результатом грубой ошибки в определении, исключаются из учета.

Расположение кривой определяют так, чтобы она исходила из нулевой отметки под углом ~45 ° к осям координат: при этом достигается наибольшая точность измерений. Последней способствует также выбор оптимального, достаточно крупного масштаба.

Примеры: определение общего белка в сыворотке крови, гемоглобина.