Організація бактеріологічної лабораторії 1

об єкта й заповнюючи всі проміжки між ними, атоми важких металів

"забарвлюють" фон, на якому виступають найменші деталі будови мікроорганізмів.

Широко також використовують ультратонкі зрізи клітин, бактерій і вірусів, що дає змогу вивчити їх структуру на субклітинному й молекулярному рівнях.

Сучасна українська й зарубіжна промисловість випускає багато моделей електронних мікроскопів (рис.5), які мають величезні можливості для вивчення мікроскопічного світу.

Методи електронної мікроскопії привели до великих успіхів у розвитку таких наук як цитологія, бактеріологія, генетика і, особливо, вірусологія.

Успішно розвивається імунна електронна мікроскопія, яка дає змогу визначити родову належність вірусів, що використовується для експрес-діагностики багатьох вірусних інфекцій.

Бактеріологічний, серологічний, біологічний та алергічний методи діагностики інфекційних хвороб детально викладені в наступних розділах.

Виготовлення мазків і методи їх забарвлення.

Бактеріоскопічне дослідження будь-кого клінічного матеріалу, де знаходяться збудники інфекційних хвороб, є однією з найпоширеніших мікробіологічних методик. У лабораторній практиці частіше проводять мікроскопію фіксованих забарвлених мазків і рідше нативних препаратів у вигляді надавленої і висячої крапель. Їх виготовляють на заздалегідь підготовленому і оснащеному робочому місці.

На столі повинні бути лише необхідні матеріали, інструменти і пристрої:

клінічний матеріал (кров, гній, слиз, харкотиння, сеча, випорожнення та ін.),

культури мікроорганізмів у пробірках або чашках Петрі, бактеріологічні петлі,

піпетки, пінцети, штативи, предметні скельця, газовий пальник, ізотонічний розчин хлориду натрію, розчини барвників, лотки з рейками для фарбування мазків, промивалка з водою, фільтрувальний папір, банка з дезрозчином для

знезараження використаних препаратів і піпеток. Доцільно в лабораторії обладнати окремий столик для забарвлення мазків.

Препарати-мазки виготовляють на предметних скельцях, товщина яких із-за оптичних властивостей конденсора Аббе не повинна перебільшувати 1-1,2

мм. Скельця необхідно заздалегідь ретельно знежирити. Для цього на протязі доби їх витримують у концентрованій сірчаній кислоті або кип ятять у суміші

6 % розчину двохромового калію і сірчаної кислоти, ретельно промивають проточною водою, переносять у банку з 96 спиртом, де вони зберігають до вживання. Можна знежирені і витримані в спирті скельця витерти насухо льняною тканиною і зберігати в герметично закритій скляній банці. Крапля води, нанесена на холодне знежирене скло, повинна рівномірно розтікатися, а

не збиратись у дрібні крапельки.

Виготовлення препаратів-мазків із щільного (густого) клінічного

матеріалу або з культури на твердому середовищі. Знежирене предметне скельце проводять через полум я газового пальника і після охолодження кладуть на робоче місце. Для виготовлення мазка матеріал чи культуру беруть бактеріологічною петлею з платинового або хромо-нікелевого дроту довжиною

5-6 см. Петлю закріплюють у петлетримачі. Кінець її згинають у вигляді замкнутого кільця розміром 1х1,5 м або 2х3 мм. Для деяких робіт потрібно мати цей інструмент у вигляді голки, коли кінець не згинають у кільце, а

залишають прямим.

Video

Бактеріологічну петлю прожарюють у полум ї, тримаючи її як олівець вертикально у правій руці. Два-три рази проводять через полум я і третю частину петлетримача. Не випускаючи петлі, лівою рукою беруть пробірку з 0,9 % стерильним розчином хлориду натрію а 4-им і 5-им пальцями правої руки зажимають ватно-марлеву пробку, витягують її, і вінця пробірки проносять через полум я пальника. Тримають на віддалі 15-20 см від полум я, не випускаючи пробки. Петлю вводять у пробірку і охолоджують її, торкаючись

Виготовлення мазків із харкотиння або гною. При готуванні мазків із матеріалів, які погано розтираються (гній, харкотиння), використовують два предметних скла. Невелику кількість матеріалу стерильною бактеріологічною петлею або пастерівською піпеткою наносять на середину знежиреного предметного скла і покривають його другим склом так, щоб 1/3 верхнього і нижнього скла залишалась вільною. Обидва скла сильно затискають між пальцями, роздавлюють досліджуваний матеріал і за вільні кінці розводять їх у сторони. Таким способом одержують два однакових мазки.

Video

Виготовлення мазків із крові. Стерильною голкою роблять прокол пучки 4-го пальця лівої руки. Після появи краплі крові до неї торкаються поверхнею біля краю знежиреного стерильного предметного скла, яке швидко кладуть на стіл. Краєм іншого трохи вужчого і шліфованого скельця

торкаються краплі і нахиливши його під кутом 45 швидко і обережно

проводять ним у напрямку до дальшого краю. Внаслідок капілярності кров захоплюється краєм верхнього скла і під час руху розмазується по нижньому склі (рис.8). Правильно виготовлений препарат виходить тонким, дещо просвічує та має жовтувате забарвлення.

Із крові виготовляють також препарат "товстої краплі". На предметне скло наносять роздільно 2-3 звичайні краплі крові, злегка змішують їх скляною паличкою, петлею або кутом іншого предметного скла так, щоб утворилось плоске кров яне п ятно діаметром біля 1,5 см. Такі препарати виготовляють зокрема при діагностиці малярії, поворотних тифів.

Мазки-відбитки роблять із органів трупів людей і тварин, харчових продуктів щільної консистенції (сир, м ясо, шинка, ковбаса, риба та ін.), а

також з поверхні молодих колоній грибів, актиноміцетів, рідше бактерій.

Розжареним у полум ї скальпелем припікають поверхню органа або харчового продукту. Потім стерильними ножицями з цієї ділянки вирізають шматочок тканини. Поверхнею зрізу торкаються предметного скла у 2-4 місцях, роблячи

мазок-відбиток. Такі ж мазки-відбитки можна виготовити з ділянки шкіри або

слизової оболонки. Притискання досліджуваного об єкта до скла повинно бути

строго вертикальним тривалістю 1-2 с. Мазки-відбитки з колоній роблять на покрівних скельцях.

Висушування і фіксування препаратів-мазків. Виготовлені мазки висушують при кімнатній температурі або в термостаті. Тонкі мазки швидко

висихають на повітрі, більш товсті можна висушувати над полум ям газового

пальника. Предметне скло при цьому тримають за ребра 1-им і 2-им пальцями правої руки мазком догори. Щоб не допустити денатурації білків бактерій і порушення їх внутрішньої структури ступінь нагрівання контролюють середнім пальцем, який знаходиться під предметним склом.

Висушені препарати необхідно фіксувати до поверхні скла.

Незафіксований мазок є заразним, тому при роботі з ним треба бути дуже обережним, не торкатись до нього руками. При фіксації одночасно відбувається прикріплення бактерій до скла та їх знезараження. До того ж вбиті

мікроорганізми значно краще забарвлюються.

У лабораторній практиці найпоширенішим методом фіксування мазків є

фламбування тобто фіксація в полум ї газового пальника або спиртівки. При

цьому мазок тримають так само, як при висушуванні і тричі проводять його

через полум я. Весь процес фіксації триває 5-6 с, а дія жару 2 с. Більш

тривале фіксування жаром зменшує якість препарату, а недофіксований мазок при наступній обробці змивається і таїть в собі небезпеку зараження.

При вивченні деяких структур мікробних клітин, а також мазків крові,

відбитків органів використовують такі фіксуючі рідини як етанол (протягом 10-

15 хв), метанол (5 хв), ацетон (5 хв), суміш Никифорова (10-15 хв), пари формаліну або осмієвої кислоти (декілька секунд). При такому обережному фіксуванні значно краще зберігаються і виявляються всі структури клітин і бактерій.

Забарвлення препаратів-мазків. Морфологію бактерій вивчають, як правило, на зафіксованих і забарвлених препаратах. Незабарвлені

мікроорганізми, за виключенням грибів, погано видимі у світловому мікроскопі із-за їх малої контрастності. Для фарбування мазків у бактеріологічних лабораторіях широко вживають анілінові барвники. Вони поділяються на кислі,

нейтральні та основні. Останні добре забарвлюють як ядерний апарат, так і цитоплазматичні структури. Позитивно заряджена фарбуюча частина їх молекули швидше і повніше вступає в сполуку з негативно зарядженою бактерійною клітиною. Кислі ж барвники фарбують мікробів значно слабкіше.

Здатність та індивідуальна особливість бактерій фарбуватись тими чи іншими барвниками називають їх тинкторіальними властивостями.

У повсякденній лабораторній практиці найчастіше вживають такі

барвники: червоні фуксин основний (діамантфуксин, солянокислий розанілін

або парарозанілін), фуксин кислий, нейтральний червоний, сафранін, конго червоний; фіолетові генціан-, кристал- і метил-віолет; сині метиленовий і толуїдиновий синій, трипановий голубий; зелені малахітовий, брильянтовий зелений; жовто-коричневі везувін, хризоїдин та ін.

Основні види барвників, що застосовуються в мікробіологічній практиці:

Дають наступне забарвлення

Для забарвлення мазків необхідно мати набір фарбуючих розчинів у флаконах з піпетками і гумовими балончиками. Їх зручно розміщувати у дерев яному штативі (колодці з гніздами). Змивання барвників і прополоскування препаратів роблять за допомогою спеціальних пристроїв

(рис.).

Запропоновані численні методи забарвлення бактерій. Вони поділяються на прості й складні.

Прості способи забарвлення бактерій

Простий метод забарвлення дає можливість дослідити загальну морфологію мікробів, їх розміри, форму, кількість, локалізацію, взаємне розташування клітин тощо. Але за його допомогою неможливо вивчати внутрішню структуру бактерій та їх різне відношення до декількох барвників.

Простим забарвленням називають таке, при якому застосовують лише один барвник. Найчастіше використовують основний розведений фуксин Пфейфера і лужну метиленову синьку Леффлера. Фуксином фарбують 1-2 хв, а

синькою 3-5 хв. Препарати, що містять, окрім бактерій, тканинні й клітинні елементи макроорганізму, краще забарвлювати метиленовою синькою, яка фарбує фон препарату порівняно слабко, а бактерії значно інтенсивніше.

Методика виготовлення та забарвлення мазків. Мазок перед забарвленням висушують на повітрі або над полум’ям пальника і фіксують після повного висихання. Фіксацію проводять у полум’ї пальника, тричі проносячи скельце через полум’я стороною, на якій немає мазка. Необхідно стежити, щоб загальний час перебування препарата в полум’ї не перевищував

5-6 секунд. Достатність фіксації можна перевірити, торкнувшись тильною стороною скельця шкіри кисті: скло повинно бути гарячим, але не створювати відчуття опіку. Фіксування проводять для того, щоб вбити мікроорганізми і прикріпити їх до скла. Вбиті бактерії краще сприймають барвники.

Зафіксований препарат кладуть на спеціальну підставку над лотком,

наносять одну-дві краплини барвника. Фарбувати мазок фуксином Пфейффера необхідно 1-2 хв, а лужним метиленовим синім - 3-5 хв. Після забарвлення препарат промивають водопровідною водою до зникнення струмочків барвника, висушують фільтрувальним папером і мікроскопують.

У повсякденній мікробіологічній практиці найчастіше використовуються основні барвники: фуксин основний, нейтральний червоний, конго червоний

(дають червоне забарвлення), метиленовий та толуїдиновий синій (голубе,

синє), генціанвіолет, метиленовий фіолетовий (фіолетове), хризоїдин, везувін

(жовто-коричневе), брильянтовий зелений, малахітовий зелений (зелене) та інші.

Існуючі методи фарбування можна поділити на прості й складні. При простих використовують один барвник, який надає змогу виявити, в основному, форму мікроорганізмів. При висушуванні мазків за допомогою листків фільтрувального паперу потрібно кожного разу користуватися новими, так як при повторному вживанні переносяться забарвлені бактерії з одного мазка на інший, що може привести до невірних висновків.

Video

Виготовлення барвників для простого забарвлення

1. Фуксин основний готують у вигляді концентрованого фенолового фуксину Циля. Він дуже стійкий, може зберігатись на протязі декількох місяців. У концентрованому вигляді вживається лише для фарбуваня спор і кислостійких бактерій. Для простого забарвлення та за методом Грама його розводять дистильованою водою 1:10, отримуючи так званий розведений, або водний фуксин Пфейфера. Цей розчин дуже нестійкий і його готують безпосередньо перед вживанням.

Спочатку фуксин з кристалами фенолу і гліцерином розтирають у ступці до однорідної маси, потроху додаючи спирт, потім, весь час перемішуючи,

доливають дистильовану воду. Розчин витримують при кімнатній температурі протягом 48 год і фільтрують. З нього потім виготовляють водний фуксин.

2. Метиленова синька. Спочатку готують насичений спиртовий розчин метиленової синьки, який дуже стійкий. При зберіганні його фарбуючі властивості, а також здатність давати метахроматичне забарвлення нуклеїнових сполук (напр. Волютинових зерен) значно підвищується за рахунок утворення азурів.

Насичений спиртовий розчин метиленової синьки

Із даного розчину гогтують лужну метиленову синьку за Лефлером, яку дуже широко використовують для простого методу забарвлення.

Метиленова синька за Лефлером

Лужна метиленова синька за Лефлером, як і її водно-спиртовий розчин,

можуть давати забарвлення різної інтенсивності у різних видів бактерій.

До простих методів забарвлення можна віднести і негативний спосіб Буррі. При ньому за рахунок туші створюють темний фон, а бактерії залишаються незабарвленими. Для стабільних і чітких результатів необхідно дуже ретельно підготувати суспензію туші. Вибирають найкращі сорти рідкої китайської туші й розводять її дистильованою водою 1:10. Можна натерти сухої китайської туші й довести її до такої ж густоти. Суспензію туші довго центрифугують при 3 тис об/хв. Верхній шар відсмоктують піпеткою і в надавленій краплі під імерсійним об єктивом перевіряють її на відсутність грубих частинок. Якщо суспензія хороша, її натягують у тонкі капіляри по 0,1-

0,2 мл, запаюють і стерилізують в автоклаві.

При дослідженні краплю туші з капіляра випускають на предметне скло,

добавляють крапельку матеріалу (рідину з сифілітичної виразки, культуру капсульних бактерій, лептоспір та ін.) і ретельно перемішують петлею.

Шліфованим предметним склом зі зрізаними кутами готують тонкий препарат так само, як мазок крові, висушують, не фіксують. При мікроскопії тіла бактерій, спірохет, лептоспір виглядають білими, чітко окресленими на темному димчасто-сірому фоні. Замість туші можна використати 2-10 %

розчини опалового синього, конго червоного, нігрозину, коларголу та ін. В

такому разі фон буде мати інший колір.

Необхідно враховувати, що мікроорганізми в таких препаратах не вбиті і можуть стати джерелом зараження, як і в мазках, обережно фіксованих у полум ї пальника.

Джерела інформації:

Основні:

1. Медична мікробіологія вірусологія імунологія за ред.. акад. НАНУ В.П.Широбокова. – Вінниця. – «Нова книга». – 2011, С. 35-46.

3. Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С.Широбоков В.П. «Практична мікробіологія», Тернопіль.: «Укрмедкнига», 2004, С. 22-34;