Строение клетки протистов

 фазово-контрастном микроскопе структуры клетки выглядят более темными, контрастными, чем в обычном микроско - пе, а при больших увеличениях вокруг них образуется светл ый ореол, затрудняющий рассмотрение деталей строения клетк и.

Интерференционный контраст (оптика Номарского) создает впечатление объемного изображения клетки. Изображени е при использовании оптики Номарского получается без орео ла

èвыгдядит более детальным.

Ñразвитием электронных систем эта техника была применена и к интерференционно-контрастным микроскопам. В на- чале 80-х была создана видеомикроскопия, которая позволила различать на живых клетках отдельные микротрубочки, диаметр которых составляет 0,025 мкм, что почти в 20 раз меньше длины световой волны. Для того, чтобы это стало возможно, нужно было уменьшить интенсивность освещения, т.к. человеческий глаз не может улавливать слабые различия в о с- вещенности структур на ярком общем фоне, и, соответственно, усилить слабый сигнал, поступающий от объекта. Для усиления сигнала была применена чувствительная видеокамер а, сигнал от которой превращался в цифровое изображение и вы - водился на экран монитора. Полученное изображение можно было обрабатывать средствами электроники, которые позво - ляли менять увеличение, яркость и контраст в широких пределах. Этот метод оказался особенно перспективным для усиления сигнала от слабых флюоресцентных меток, применяемых на живых объектах.

Для изучения собственно одноклеточных протистов описан - ных методов световой микроскопии вполне достаточно, т.к. клетки имеют небольшие размеры и световой пучок их легко просвечивает. Однако для исследования некоторых аспектов жизнедеятельности паразитических протистов бывает важн о проследить положение клетки в тканях хозяина, не используя при этом обычные методы фиксации, заливки, резки с последующим изучением срезов материала. Для исследования круп - ных объектов, их трехмерной реконструкции используется конфокальный микроскоп. Упрощенная схема, иллюстрирующая принцип его работы, показана на рисунке 3.4.

121

ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ КЛЕТКИ

Рис. 3.4. Упрощенная схема строения современного конфокального микроскопа.

Лазерное излучение проходит сквозь «игольное ушко» и, отражаясь от дихронного зеркала, фокусируется в одной точ ке на объекте (А); он возбуждает молекулы флюоресцентного красителя, который генерирует излучение большей длины волны. Свет от объекта проходит сквозь дихронное зеркало и фокусируется в конфокальном «игольном ушке», попадая сквозь него на детектор (Д) (Б). Весь посторонний свет, отражающийся от других частей объекта, практически не проходит сквозь «игольное ушко» и, таким образом, не маскирует необходимое нам излучение (В).

Принципиально он устроен так же, как флюоресцентный микроскоп (рис. 3.2). Однако имеется 2 главных отличия. Источником света вместо ртутной лампы служит лазер, свет от которого проходит сквозь очень маленькое отверстие, чье изо бражение фокусируется на одной определенной точке объекта, проходя через обычную систему двухронных зеркал. Флюорес - центное свечение от объекта фокусируется в другом (конфо - кальном) отверстии, откуда идет на воспринимающий детектор. Весь свет, который отражается от частей объекта, находящихся вне фокуса, отсекается и не маскирует нужное нам изображение. Таким образом, точечное изображение источни-

122

ка света фокусируется на объекте, и только от объекта отра женный свет попадает сквозь конфокальное отверстие на детектор. Сканируя объект лучом лазера, мы получаем очень точные дв ухмерные изображения, которые можно анализировать и создавать при помощи компьютера трехмерное изображение интересующих нас структур.

Электронная микроскопия

В электронном микроскопе используется принципиально иной источник света. Вместо видимого света – поток электр о- нов, длина волны которого составляет всего 0,004 нм. Следовательно, теоретически мы можем получить разрешение около 0,002 нм, или 0,02Å (рис. 70). Для сравнения, размер атома водорода в 10 раз больше. Однако на практике паспортное разрешение микроскопа в 1,2-1,4 Å уже считается идеальным. Особенности приготовления биологических объектов для элек тронной микроскопии и различные погрешности при просмотре таковы, что на практике разрешение в просвечивающем элект - ронном микроскопе составляет около 2 нм. Тем не менее, это в 100 раз выше разрешения светового микроскопа, и позволяет рассматривать микрофиламенты диаметром 2–4 нм.

Устройство просвечивающего (ПЭМ) и сканирующего (СЭМ) электронных микроскопов в сравнении со световым показано на рисунке 3.5.

Источником эмиссии электронов является нить накала като - да. Рядом с ней располагается анод. Под действием ускоряющего напряжения (80–100 Кв для ПЭМ, и 30–40 Кв для СЭМ) пучок электронов направляется по узкому туннелю колонны микроскопа, проходит сквозь объект и попадает на флюоресцирующий экран, на котором и формируется изображение. Для улучшения качества изображения в колонне создается ваку ум, пучок электронов формируют магнитные линзы (по аналогии со стеклянными линзами в световом микроскопе). Чтобы на эк - ране получилось четкое изображение, объект должен быть, с одной стороны, прозрачным для электронов, т.е. достаточно тонким (50–100 нм), а с другой стороны, структуры его должны быть достаточно плотными и могли отклонять электроны так , чтобы на экране под ними получались соответствующие им те м-

123

ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ КЛЕТКИ

Рис. 3.5. Сравнение светового (А) и электронных просвечивающего (Б) и сканирующего (В) микроскопов. Показано принципиальное сходство основных рабочих узлов. Отличие электронных микроскопов: объект помещен в вакуум, источни к излучения – поток электронов, вместо стеклянных использу ются магнитные линзы.

д – детектор, ис – источник света, кл – конденсорные линзы, л – линза, м – монитор, об – объект, ок – окуляр, ол – объективная линза, оу – отклоняющее устройство, пл – проекторная линза , фэ – флюоресцентный экран.

ные пятна и полосы. Это чередование на экране электронноплотных (темных) и электронно-прозрачных (светлых) полос

èпредставляет собой изображение объекта. Для окраски (контрастирования) биологических объектов обычно использую т соли тяжелых металлов (свинца и урана), которые, оседая на клеточных структурах, делают их непрозрачными для электронов.

Процесс приготовления объектов для ПЭМ довольно сложен

èимеет много нюансов. Однако эта процедура уже давно стал а рутинной и для овладения ею требуется лишь практика.

Наилучшими фиксаторами для ЭМ являются глутаровый альдегид и четырехокись осмия (рис. 3.6), которые образуют кова-

124

Рис. 3.6. Структурные формулы молекул глутарового альдегида (А) и четырехокиси осмия (Б).

лентные связи с макромолекулами объекта по месту двойных связей.

Оба фиксатора дополняют друг друга. Глутаральдегид связы - вает преимущественно белки, а четырехокись осмия – жиры. Углеводы практически не взаимодействуют с этими фиксатора ми.

После фиксации клетки обезвоживаются в спиртах и заливаются в полимерные материалы, которыми обычно служат эпоксидные смолы. В результате полимеризации при определенных условиях смолы затвердевают, при этом не меняя своего объема, т.е не искажая форму клетки. На специальном приборе (ультрамикротоме) получают ультратонкие срезы, которые помещаются на маленькие ненамагничивающиеся сетки (обыч - но из меди, вольфрама или платины) и контрастируются уранилацетатом и цитратом свинца. После этого сеточки с объектом помещаются в микроскоп и просматриваются при нужном увеличении.

В СЭМ используется тот же основной принцип формирования пучка, но изображение формируется иначе (рис. 3.5). Здесь исследуется поверхность объекта, которая должна быть дос таточно плотной, чтобы от нее отражались электроны. Для этог о объект покрывается (напыляется) тонким слоем тяжелого ме - талла (золото, платина, сплав платины с палладием) и монтируется на специальный столик, который позволяет поворачи - вать и наклонять объект. Отраженные от поверхности объекта вторичные электроны улавливаются детектором, который усиливает сигнал и подает его на монитор, где формируется изоб-

125

ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ КЛЕТКИ

126

Рис. 3.8. Метод замораживания-скалывания (А) и замораживаниятравления (Б).

В обоих случаях объект быстро замораживается и раскалыва ется. Затем

(А) получают реплику непосредственно со скола (см. рис. 3.7), или (Б) помещают в вакуум, где часть цитоплазмы сублимируется и о бнажаются внутренние структуры клетки, а затем изготавливается реп лика.

вл – выпаренный лед, вц – выпаренная цитоплазма, вч – внутримембранные частицы, нпм – наружная плазматическая мембрана и поверхность органелл, пм – плазматическая мембрана.

угольной) и покрывают на 1 минуту раствором соли какого-либ о тяжелого металла (фосфорно-вольфрамовой кислоты или уранилацетата). После высушивания сеточку с объектом помеща - ют в ПЭМ и просматривают. Прозрачные для электронного пуч- ка макромолекулы и другие органические структуры выгляд ят светлыми на темном фоне, образованном солями тяжелого металла, который не прозрачен для электронов. Таким способом, в частности, определяют строение мастигонем на поверхнос ти жгутиков, структуру вирусов, строение клеточной стенки ба к- терий.

Метод замораживания-скалывания

Метод получения реплик используется также для изучения внутреннего строения мембран (рис. 3.8).

Для этого клетки быстро замораживаются до температуры жидкого азота (-196° С). Обычно это происходит в присутствии антифриза, который предотвращает образование в клетке кр и- сталлов льда, разрушающего клеточные структуры, или проце сс замораживания идет при температуре жидкого пропана (-80° С), а потом объект помещается в жидкий азот. Затем заморожен-

127

ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ КЛЕТКИ

ная клетка раскалывается лезвием бритвы, и поверхность ск ола напыляется платиной. Далее процедура та же, что и при получ е- нии реплики с целого объекта: органический материал удаля ется, а реплика просматривается в ПЭМ. Сколы обычно проходят таким образом, что расщепляют мембраны, и мы можем наблюдать их внутреннее строение. Чаще всего таким образом изу ча- ют распределение внутримембранных белков.

Метод замораживания-травления (фризэтчинг)

Этот метод позволяет изучать как внешние, так и внутренни е структуры клетки (рис. 3.8). После быстрого замораживания клетки, с нее получают скол, но перед напылением ее помещают в вакуум, где при низкой температуре происходит возгон ка льда. В результате обнажаются более глубокие структуры клетки. После этого объект напыляют, затем растворяют, как и в предыдущем методе, и полученную реплику просматривают в ПЭМ. Этот метод дает прекрасные результаты при изучении скелетных структур, т.к. позволяет наблюдать трехмерную картину содержимого клетки.

Криоэлектронная микроскопия

Этот метод требует достаточно сложного оборудования. Объект сначала замораживают, затем получают с него срез на криоультрамикротоме толщиной не более 100 нм. Полученный срез помещают на сеточку, которую тут же вставляют в элект - ронный микроскоп. При этом температура объекта должна сохраняться на уровне -160° С, для чего используется специальный держатель. В вакууме микроскопа происходит возгонка льда и можно наблюдать нативные структуры клетки ничем не окрашенные, но и вполне контрастные. Так были получены фотографии вирусов и белковых филаментов мышц насекомых . Методы криофиксации (без использования химических веществ) важны и в теоретическом плане. При сложном способе химической фиксации и последующей процедуре приготовле - ния объекта для ПЭМ всегда остается сомнение в истинности получаемой картины. Криометоды позволили получить очень близкие результаты в отношении строения клетки и убедили исследователей в том, что современные химические способы фи к-

сации не вызывают артефактов.

128

ГЛАВА 4

Строение клетки протистов

Протисты являются эукариотами, поэтому им свойственны те же основные системы (поверхностный аппарат, цитоплазма и ядро), какие мы встречаем в клетках многоклеточных живот - ных и растений. В цитоплазме протистов обнаруживаются митохондрии и хлоропласты, аппарат Гольджи и пероксисомы. В то же время, их клетки имеют множество морфологических ос о- бенностей, которые встречаются только у протистов. Наибол ее разнообразны различные цитоскелетные образования, к кот о- рым можно отнести как внутренние цитоплазматические стр уктуры, так и как наружные образования (покровы), и, кроме того , минерализованные скелетные элементы. По-видимому, именно развитие цитоскелета, как основной интегрирующей системы клетки, отличает протистов от клеток других эукариот, поэтому, помимо обычного набора органелл, особое внимание будет уделено строению цитоскелета, а также структурам, х а- рактерным только для протистов.

4.1. Покровы

Как у всякой эукариотной клетки, основу покровов протистов составляет плазмалемма, образованная поверхностной мембраной и прилегающим к ней снаружи слоем гликокаликса. По - верхностная мембрана образована билипидным слоем, и на электронограммах выглядит как трехслойная структура. Он а обычно содержит внутримембранные частицы, или интеграль - ные белки. Эти частицы часто образуют правильные агрегаты , которые выявляются на сколах при расщеплении мембраны. Назначение этих агрегаций не установлено. В состав гликок а- ликса входят периферические белки, выступающие наружу хвостовые участки мембранных гликолипидов и гликопроте и- нов, а также рабочие части интегральных белков. Морфологи -

129

ГЛАВА 4. СТРОЕНИЕ КЛЕТКИ ПРОТИСТОВ

Рис. 4.1. Схема строения покровов у протистов на поперечном срезе клетки. (Ориг.)

А – плазмалемма, Б–Е – надмембранные усложнения покровов: Б – гликостили, В – чешуйки, Г – клеточная стенка, Д – перилемма, Е – домик, или лорика; Ж–Н – субмембранные усложнения покровов: Ж – тубулемма, З – гребенчатая тубулемма, И – перипласт, К – кутикула эвгленовых, Л – двойная мембрана апузомонад, М – пелликула, Н – тека, или амфиесма. а – альвеола, бп – белковая полоска, д – домик, гл – гликокаликс, гс – гликостили, кс – клеточная стенка, мт – микротрубочки, пл – перилемма, пм – плазматическая мембра - на, тп – текальная пластинка, ч – чешуйки.

чески он неотделим от мембраны и состоит преимущественно из полисахаридов и гликопротеинов.

Очень многие протисты покрыты только плазмалеммой, но существует и немало организмов, обладающих дополнительн ы- ми структурами, усложняющими строение покровов, призванными усиливать их защитную функцию или участвовать в реализации функций движения, хеморецепции, размножения, поддержания формы клетки, питания, дыхания и энергетиче- ского обмена. Многообразие покровов протистов очень вели ко,

130