- •Министерство здравоохранения ссср
- •1. Колориметрические методы определения белка
- •1. Определение белка с биуретовым реактивом
- •2. Микроопределение белка с реактивом Бенедикта
- •3. Определение белка по методу Лоури
- •4. Определение белка по методу Лоури
- •5. Определение белка по методу Бредфорд
- •6. Определение белка по методу Седмака
- •7. Определение белка по методу Флореса
- •II.Спектрофотометрический метод определения белка
- •III. Определение белка по содержанию общего азота
- •1. Микрометод Кьельдаля
- •2. Определение белка с реактивом Несслера
- •1. Определение ретинола ацетата
- •2. Определение содержания витамина а
- •3. Определение содержания тиамина хлорида
- •4. Определение содержания рибофлавина (витамина в2)
- •5. Определение содержания
- •6. Определение цианокобаламина (витамина в12)
- •7. Определение содержания
- •8. Определение содержания никотинамида
- •9. Определение содержания
- •10. Определение содержания рутина (витамина р)
- •11. Определение альфа - токоферола ацетата (витамина е)
- •12. Определение кальция пантотената
- •3',3",5', 5"-Тетрабром-м-крезолсульфофталеин
- •3', 3", 5", 5" -Тетрабромфенолсульфофталеин
- •3',3",5',5"-Тетрабромфенолсульфофталеина
- •1,1',1",8"-Тетраокси-(8,2',8',2"-бис-азотринафталин)
- •3,6,3',6',3",6"-Гексасульфокислоты моногидрат
- •1. Cormus ledi palustris
- •2. Cortex frangulae
- •3. Cortex quercus
- •4. Cortex viburni
- •5. Flores calendulae
- •6. Flores centaureae cyani
- •8. Flores crataegi
- •9. Flores helichrysi arenarii
- •10. Flores sambuci nigrae
- •11. Flores tanaceti
- •12. Flores tiliae
- •13. Folia belladonnae
- •14. Folia digitalis
- •15. Folia eucalypti viminalis
- •16. Folia farfarae
- •17. Folia hyoscyami
- •18. Folia menthae piperitae
- •19. Folia menyanthidis trifoliatae
- •20. Folia plantaginis majoris
- •21. Folia orthosiphonis staminei
- •22. Folia salviae
- •23. Folia sennae
- •24. Folia stramonii
- •25. Folia urticae
- •26. Folia uvae ursi
- •27. Folia vitis - idaea
- •28. Fructus alni
- •29. Fructus anethi graveolentis
- •30. Fructus anisi vulgaris
- •31. Fructus carvi
- •32. Fructus crataegi
- •33. Fructus foeniculi
- •34. Fructus juniperi
- •35. Fructus myrtilli
- •36. Fructus padi
- •37. Fructus rhamni catharticae
- •38. Fructus rozae
- •39. Fructus sorbi
- •40. Fructus viburni
- •41. Gemmae betulae
- •42. Gemmae pini
- •43. Herba adonidis vernalis
- •44. Herba artemisiae absinthii
- •45. Herba bidentis
- •46. Herba bursae pastoris
- •47. Herba chelidonii
- •48. Herba centaurii
- •49. Herba convallariae
- •50. Herba equiseti arvensis
- •51. Herba gnaphalii uliginosi
- •52. Herba hyperici
- •53. Herba millefolii
- •54. Herba leonuri
- •55. Herba origani
- •56. Herba polygoni avicularis
- •57. Herba polygoni hydropiperis
- •58. Herba polygoni persicariae
- •59. Herba thermopsidis lanceolatae
- •60. Herba serpylli
- •61. Herba thymi vulgaris
- •62. Herba violae
- •63. Inonotus obliquus
- •64. Radices althaeae
- •65. Radices araliae mandshuricae
- •66. Radices ginseng
- •67. Radicus ononidis
- •68. Radices rhei
- •69. Radices taraxaci
- •70. Rhizomata bergeniae
- •71. Rhizomata bistortae
- •72. Rhizomata calami
- •73. Rhizomata et radices inulae
- •74. Rhizomata cum radicibus polemonii
- •75. Rhizomata et radices rhodiolae roseae
- •76. Rhizomata ет radices rubiae
- •77. Rhizomata cum radicibus valerianae
- •78. Semina cucurbitae
- •79. Semina lini
- •80. Semina schisandrae
- •81. Strobili piceae abietis
- •82. Styli cum stigmatis zeae maydis
- •83. Thalli laminariae
6. Определение цианокобаламина (витамина в12)
Содержание цианокобаламина определяют микробиологическим методом с Escherichia coli 113-3 в качестве тест - микроорганизма.
Точную навеску порошка растертых драже, таблеток или количество таблеток, покрытых оболочкой, растертых в порошок, указанное в соответствующих частных статьях, количественно переносят водой в мерную колбу определенной вместимости и доводят объем раствора водой до метки, перемешивают и фильтруют. Из полученного раствора делают разведение 1% раствором натрия цитрата с таким расчетом, чтобы концентрация раствора для анализа была близкой к контрольной концентрации раствора Государственного стандартного образца - 0,05 мкг в 1 мл.
В чашки Петри (6 чашек для построения стандартной кривой и 3 чашки для раствора испытуемого препарата) одинакового диаметра с ровным и плоским дном, установленные на горизонтальном столе, отрегулированном по ватерпасу, разливают по 10-12 мл расплавленной и охлажденной до температуры 48-50 град. С основной среды, засеянной суспензией Е. coli 113-3 из расчета от 4 до 6 мл суспензии на 200 мл основной среды. После застывания среды на каждой чашке стерильным бором делают по трафарету под углом 60 град. С друг к другу 6 лунок диаметром 8 мм.
В три лунки (через одну) 6 чашек, используемых для построения стандартной кривой, и 3 чашек - для раствора испытуемого препарата, вносят по 0,1 мл раствора Государственного стандартного образца контрольной концентрации (0,05 мкг/мл). В три лунки (через одну) каждых 3 чашек вносят по 0,1 мл одной из концентрации остальных растворов Государственного стандартного образца, а также раствора испытуемого препарата. Чашки выдерживают в термостате при 37 град. С от 16 до 18 ч. После этого измеряют диаметры зон стимуляции роста тест - микроорганизма для каждой концентраций растворов Государственного стандартного образца.
После измерения зон роста для всех концентраций рассчитывают среднюю величину зоны, учитывая в каждом случае 3 чашки, т. е. 9 зон, затем рассчитывают среднюю величину зоны для контрольной концентрации, учитывая все чашки, т. е. 27 зон.
По разности между средней величиной зоны контрольной концентрации раствора (0,05 мкг/мл), выведенной из всех чашек, и средней величиной зоны контрольной концентрации раствора Государственного стандартного образца, выведенной из 3 чашек с каждой отдельной концентрацией, находят поправку к величине зоны данной концентрации. Найденную поправку прибавляют к средней величине зоны данной концентрации, если она положительная, и вычитают, если она отрицательная. Аналогичным образом делают поправку к концентрации раствора испытуемого препарата.
Содержание C63H88CoN14O14P (цианокобаламина) в одном драже или одной таблетке в граммах (X) вычисляют по формуле:
С х б х К
Х = -------------,
а х 1 000 000
где С - содержание цианокобаламина в 1 мл испытуемого раствора, найденное по стандартной кривой, в микрограммах; К - коэффициент разведения; а - навеска препарата в граммах или количество таблеток, покрытых оболочкой; б - средняя масса одного драже в граммах; 1 000 000 - пересчет в граммы.
Примечания. 1. Приготовление раствора Государственного стандартного образца цианокобаламина: 0,0250 г Государственного стандартного образца цианокобаламина в пересчете на 100% вещество растворяют в 25% спирте в мерной колбе вместимостью 250 мл и доводят объем раствора тем же спиртом до метки.
1 мл полученного раствора содержит 100 мкг цианокобаламина (основной раствор).
Раствор годен в течение 2 мес при хранении при температуре 4-6 град. С в банке оранжевого стекла с притертой пробкой. 1 мл основного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки (рабочий раствор). Раствор годен в течение 5 сут при хранении при температуре от 12 до 15 град. С.
1 мл рабочего раствора содержит 1 мкг цианокобаламина. Из рабочего раствора Государственного стандартного образца в день определения готовят растворы, содержащие 0,025; 0,05 и 0,075 мкг цианокобаламина в 1 мл. Для этого соответственно 2,5; 5 и 7,5 мл рабочего раствора Государственного стандартного образца помещают в мерные колбы вместимостью 100 мл, доводят объемы растворов в колбах 1% раствором натрия цитрата до метки и перемешивают.
Раствор, содержащий 0,05 мкг цианокобаламина в 1 мл, принимают за раствор Государственного стандартного образца контрольной концентрации.
2. Построение стандартной кривой: по исправленным значениям величин зон приготовленных концентраций и средней величине зоны контрольной концентрации из всех чашек строят стандартную кривую, откладывая на оси абсцисс концентрации цианокобаламина в мкг/мл, а на оси ординат - соответствующие им величины диаметров зон роста. По полученным точкам вычерчивают кривую.
Применяемые для построения кривой концентрации не должны отличаться от контрольной концентрации более чем на -40 или +50%.
3. Хранение и подготовка тест - культуры для анализа: музейную культуру выращивают на скошенной агаровой среде и хранят в холодильнике. Один раз в месяц культуру пересеивают на свежую среду и после переноса выдерживают от 16 до 18 ч при 37 град. С.
Состав среды для хранения культуры:
казеинового кислотного гидролизата 10% 6 мл
калия фосфата двузамещенного (х. ч.) 0,02 г
железа сульфата (х. ч.) 0,0005 г
магния сульфата (х. ч.) 0,02 г
L-аспарагина (ч.) 0,02 г
глицерина (ч.) 0,2 г
агара микробиологического 1,5 г
цианокобаламина 10 мкг
воды до 100 мл
рН среды до стерилизации 7,0 (потенциометрически).
Ингредиенты растворяют последовательно в воде.
Аспарагин растворяют отдельно в 10 мл воды с прибавлением 2 капель раствора хлористоводородной кислоты (1 моль/л) при слабом подогревании и прибавляют к раствору солей; устанавливают рН полученной смеси до 7,0 15% раствором едкого натра, доводят объем среды водой до 100 мл, прибавляют 0,2 г глицерина и 1,5 г агара микробиологического. Смесь подогревают на водяной бане до полного растворения агара, затем прибавляют 10 мкг цианокобаламина. За сутки до проведения анализа тест - культуру пересевают на скошенный пептонно - солевой агар следующего состава:
пептона ферментативного сухого 2 г
натрия хлорида (х. ч.) 0,5 г
агара микробиологического 1,8 г
воды до 100 мл
рН среды до стерилизации 7,0 (потенциометрически).
Обе среды разливают в пробирки по 5 мл, стерилизуют насыщенным паром под давлением в паровом стерилизаторе при 1 ати (0,1 МПа) 20 мин. Пробирки охлаждают в наклонном положении. На скошенный агар делают посев музейной культуры. Тест - культуру инкубируют от 16 до 18 ч при 37 град. С и используют для приготовления посевного материала.
4. Приготовление 10% казеинового кислотного гидролизата: 100 г казеина размолотого смешивают в колбе вместимостью 1 л с 500 мл 20% раствора хлористоводородной кислоты. Смесь нагревают с обратным холодильником в течение 24 ч. Первые 5-8 ч до растворения казеина нагревание проводят на кипящей водяной бане, а затем на электроплитке с асбестовой сеткой. Из полученного гидролизата при пониженном давлении отгоняют хлористоводородную кислоту. К густому остатку прибавляют 300 мл воды, перемешивают и снова отгоняют до получения густого сиропа. Указанную операцию повторяют дважды, растворяют оставшуюся массу приблизительно в 100 мл воды, устанавливают рН 3,5 при помощи раствора едкого натра (5 моль/л) и объем раствора доводят водой до 1 л. К раствору прибавляют 20 г угля активированного осветляющего, встряхивают в течение 1 ч, затем фильтруют на воронке Бюхнера с отсасыванием. Обработку углем повторяют еще раз и получают бесцветный или светло - желтый раствор, который разливают в колбы по 100 мл и стерилизуют насыщенным паром под давлением в паровом стерилизаторе при 1 ати (0,1 МПа) 20 мин.
5. Приготовление 20% раствора хлористоводородной кислоты: 425 мл концентрированной хлористоводородной кислоты (d 1,19) разбавляют водой до 1 л.
6. Приготовление посевного материала: делают смыв суточной тест - культуры со скошенного пептонно - солевого агара раствором натрия хлорида изотоническим 0,9%. Плотность микробной взвеси должна быть от 1 до 2 млрд микробных клеток в 1 мл.
7. Приготовление основной питательной среды.
Состав среды:
аммония хлорида (х. ч.) 2 г
натрия хлорида (х. ч.) 3 г
калия фосфата двузамещенного (х. ч.) 0,4 г
натрия цитрата трехзамещенного (х. ч.) 3 г
сахара молочного 3 г
агара микробиологического 15 г
воды дистиллированной до 1 л
рН среды до стерилизации 7,0 (потенциометрически).
Среду разливают по 200 мл в колбы и стерилизуют насыщенным водяным паром в автоклаве при 1 ати (0,1 МПа) 20 мин. Хранят в прохладном месте не более 2 мес. Перед розливом в чашки Петри в расплавленную среду прибавляют по 5 мл стерильного 40% раствора глюкозы на каждые 200 мл среды.
Раствор глюкозы стерилизуют при 0,5 ати (0,05 МПа) в течение 15 мин.
7. Приготовление 1% раствора натрия цитрата: 10 г натрия цитрата растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1 л и доводят объем раствора водой до метки.
Раствор годен в течение 7 сут при хранении при температуре от 5 до 10 град. С.